牛蒡低聚果糖诱导拟南芥对Pseudomonas syringae Pv.tomato DC3000的抗性及其作用机制的研究

摘要

激发子(elicitor)是一类能激活寄主植物产生抗病防卫反应的生物或非生物因子。牛蒡低聚果糖(Burdockfructooligosaccharide，BFO)是从牛蒡(ArcitumlappaL.)根中分离出来的储存型低聚糖。前期研究表明，BFO是一种有效的激发子，能够增强植物对多种病原真菌和病毒的抗性。细菌是仅次于真菌和病毒的第三大类植物病原物，BFO是否能够增强植物对病原细菌的抗性还没有研究。引发(priming)，是指被激发子诱导后的细胞对随后的侵染发生更强烈的防卫反应的现象。引发是植物诱导抗性的重要机制;气孔关闭可以作为抵御细菌入侵的屏障，也是植物抗病反应之一;这两个机制都可能影响植物对病原细菌的抗性。本文以模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)为材料，研究了BFO处理对拟南芥防御Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000(PstDC3000)的影响及其引发效应。
　　研究发现，5.0g/LBFO预处理能够显著抑制PstDC3000在拟南芥叶片组织中增殖，减轻发病症状。BFO处理后接种PstDC3000，引发拟南芥发生更强更快的细胞和分子防卫反应，拟南芥叶片组织出现过氧化氢(hydrogenperoxide，H2O2)积累、胼胝质沉积和过敏性细胞死亡;PstDC3000单独接种，拟南芥没有发生显著的H2O2积累、胼胝质沉积和过敏性细胞死亡。BFO处理3d后接种PstDC30006h，比单独接种PstDC3000，拟南芥PR1基因的表达量升高27.5倍，PAL1基因的表达量升高2.7倍。在接种PstDC3000时，添加过氧化氢清除剂过氧化氢酶(catalase，CAT)，BFO的引发效应被抑制。BFO诱导的引发效应在不积累水杨酸(salicylicacid，SA)的转基因植株NahG、SA缺陷突变体sid2和SA不敏感突变体npr1-1中被抑制，但在脱落酸(abscisicacid，ABA)缺陷突变体aba3-1中，BFO的引发效应不受影响。这些研究结果表明，BFO处理增强了拟南芥对PstDC3000的抗性;BFO诱导拟南芥进入引发状态，再接种病原菌，拟南芥表现出更强的细胞和分子防卫反应，即引发效应;BFO的引发效应依赖H2O2、SA信号通路和NPR1基因，但可能不依赖ABA信号通路。
　　研究了BFO处理3d内的拟南芥组织内活性氧相关变化及其对引发的作用。结果显示，BFO处理引起拟南芥组织内H2O2积累，并在6h达到高峰，此时H2O2含量是对照的2.4倍;24h后H2O2含量基本恢复到原来水平并保持稳定。GST1基因是植物抗膜脂过氧化的关键基因，其表达受氧化应激调控，BFO处理引起GST1基因表达上调;活性氧清除酶相关基因FSD1、CAT1、CAT2、APX1和ZAT10基因表达也上调。活性氧清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)，过氧化氢酶(CAT)的酶活性升高。进一步研究发现，BFO单独处理能够诱导拟南芥积累H2O2，但不引起胼胝质沉积和过敏性细胞死亡。BFO处理3d后接种PstDC3000，不仅激发拟南芥组织内H2O2积累，还引起了过敏性细胞死亡和胼胝质沉积。在BFO处理时添加CAT，外源CAT抑制了BFO诱导的H2O2积累;再接种PstDC3000后，拟南芥组织不发生显著的H2O2积累、胼胝质沉积和过敏性细胞死亡，同时拟南芥对PstDC3000的抗性也被抑制。这些结果表明BFO处理可以诱导拟南芥活性氧积累，影响拟南芥的氧化-还原平衡，使氧化态升高;BFO诱导的活性氧积累和氧化还原状态的改变使植物进入引发状态(primingstate)，对病原菌的刺激表现出更强的防卫反应。
　　气孔运动与植物防御反应关系密切。研究了BFO对气孔运动的影响，结果显示，BFO处理可以诱导拟南芥气孔关闭，并诱导拟南芥保卫细胞内积累活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)。我们选用研究气孔运动的常用植物豌豆进一步研究了BFO诱导气孔关闭的作用机制。研究发现，BFO处理可以诱导豌豆气孔关闭，200μg/mLBFO使豌豆气孔开度减小54.5％，并且在20-200μg/mL范围内，与BFO的剂量呈正相关。BFO处理20min时，豌豆保卫细胞中ROS和一氧化氮(nitricoxide，NO)含量显著增加，ROS和NO的荧光强度分别是对照的2.8倍和1.64倍。ROS抑制剂过氧化氢酶同时抑制了BFO诱导的ROS积累和NO积累;而NO抑制剂L-NAME抑制了BFO诱导的NO积累，部分抑制了BFO诱导的ROS积累。过氧化氢酶和L-NAME都抑制了BFO诱导的气孔关闭。这些研究结果表明，BFO可以诱导豌豆气孔关闭;BFO诱导的气孔关闭依赖ROS和NO信号;BFO诱导的ROS可能位于NO上游，是其诱导NO所必需的;NO位于ROS下游，并可能反作用于ROS。
　　BFO是植物自身产生的一种菊糖型低聚糖，本研究证实BFO能够增强植物对病原细菌的抗性，揭示了BFO的引发效应，发现BFO可以诱导气孔关闭，对理解BFO诱导植物抗病的作用机制有一定理论价值，也为BFO在农业生产上的应用进一步提供了理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明及缩写词

第一章 前言

1．1 植物的主动防卫机制

1．2 植物的诱导抗性反应

1．2．1 植物抗病性反应中的快速反应

1．2．2 植物抗病性中表现的较慢反应

1．3 植物诱导抗性的重要机制-引发

1．4 气孔运动在植物防卫反应中的作用

1．5 本研究的目的、意义

第二章 牛蒡低聚果糖引发拟南芥对Pseudomonas syringae pv tomato DC3000的防卫反应

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 植物材料

2．2．2 化学试剂和主要仪器

2．2．3 牛蒡低聚果糖的制备及处理

2．2．4 细菌繁殖、接种及生长测定

2．2．5 细胞防卫反应检测

2．2．7 基因表达分析

2．2．8 数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 BFO对拟南芥抗病性的影响

2．3．2 BFO处理引发拟南芥防卫反应

2．3．3 H2O2在BFO诱导的引发反应中的作用

2．3．4 SA、ABA在BFO诱导的引发反应中的作用

2．4 讨论

第三章 活性氧在牛蒡低聚果糖诱导的引发防卫反应中的作用

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 细胞防卫反应检测

3．2．2 基因表达分析

3．2．3 酶活测定

3．2．4 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 牛蒡低聚果糖处理对拟南芥组织氧化还原平衡的影响

3．3．2 氧化还原状态改变对牛蒡低聚果糖引发防卫反应的影响

3．4 讨论

第四章 牛蒡低聚果糖对气孔运动的影响

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 植物材料

4．2．2 化学试剂和主要仪器

4．2．3 气孔开度测量

4．2．4 保卫细胞中NO和ROS测量

4．2．5 拟南芥培养、气孔开度、保卫细胞ROS测量

4．2．6 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 BFO对拟南芥气孔运动的影响

4．3．2 BFO对豌豆气孔运动的影响

4．3．3 ROS和NO信号在BFO诱导的豌豆气孔运动中的作用

4．4 讨论

第五章 讨论

参考文献

读博期间发表和投稿的学术论文

致谢

附件