骨髓间充质干细胞对小鼠受损胸腺功能修复作用的研究

摘要

研究背景： 造血系统恶性疾病的化疗、放疗、尤其是异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cells transplantation，HSCT)等治疗会导致不同程度的免疫功能缺陷，另外，随着核技术的广泛应用，放射病发生的可能性也逐渐增加。重度急性放射病(acute radiation syndrome，ARS)患者常因造血功能衰竭、全身多脏器损伤、免疫功能低下继发严重感染而死亡。虽然造血干细胞移植技术以及细胞因子治疗可能使放射病患者造血功能得到一定程度的恢复，但是移植预处理阶段应用的大剂量坏磷酰胺、全身照射(Total Body Irradiation，TBI)，抗胸腺球蛋白(Anti-thymoeyteGlobulin，ATG)等，以及移植后防治移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)所使用的环孢素A(ciclosporin)等免疫抑制剂，都会使病人发生严重的免疫缺陷，继发严重感染。胸腺是中枢免疫器官，骨髓生成的淋巴样祖细胞迁入胸腺后，经过分化、发育，成为成熟T细胞，迁移出胸腺，定位于外周淋巴组织，対机体免疫功能的维持和调节起着重要作用。但胸腺也是对造血干细胞移植预处理及辐射高度敏感的器官，在放疗、化疗、移植后或者重度ARS发生时常被累及而影响机体的免疫功能。因此，及时修复受损伤的胸腺功能能够有效改善上述患者的免疫功能。骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstem cells，MSCs)具有定向分化、造血支持及免疫调节的作用。许多体外研究及部分体内试验发现MSCs对T淋巴细胞的免疫应答具有负向调节作用。但是另外有一些试验报道MSCs对T淋巴细胞的分化、成熟有正向调节作用，对维持胸腺微环境、促进T淋巴细胞成熟有重要作用，可以促进受照射小鼠胸腺和脾脏的细胞数的恢复。那么，MSCs能否对受到损伤的胸腺功能起到修复作用，其基本机理是怎样的，是否可以作为一种促进免疫重建的新手段，目前的相关研究不多，本实验将就这一问题进行探讨。T细胞免疫可参与介导许多疾病过程，MSCs已经被应用于造血干细胞移植以减轻GVHD，诱导免疫耐受。为了进一步探索MSCs在血液系统疾病中对免疫、造血方面的作用，拟对T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等疾病进行部分MSCs临床应用，为下一步临床研究做初步探讨。 研究目的： 建立小鼠胸腺放射性损伤模型，研究MSCs对损伤胸腺的修复作用和机制，为放化疗、造血干细胞移植后等患者的免疫重建探索新的治疗手段;对MSCs在血液系统疾病中对免疫、造血方面的作用做初步临床探讨。 研究方法： 1.通过percoll分离和贴壁筛选法，改良既往小鼠MSCs培养方法，分离、纯化雄性C57小鼠骨髓MSCs。通过细胞形态、细胞表型和定向分化实验，验证所培养的细胞是否为骨髓MSCs。 2.选择6Gy、9 Gy、12 Gy三个不同剂量60Coγ射线照射雌性BALB/C小鼠，筛选胸腺放射性损伤小鼠模型。分别以三个不同照射剂量经前胸野单次照射小鼠纵膈部位，使用10cm铅板保护其它部位。选择剂量率154.7cGy/min，小鼠与放射源相距80cm，辐照的时长分别设定为257秒、386秒、514秒。辐照以后观察小鼠的体重、胸腺指数、胸腺等组织病理、外周血像、胸腺及外周血T淋巴细胞亚群变化。根据上述指标筛选最佳照射剂量，建立该剂量胸腺损伤模型，作为MSCs修复胸腺功能研究的载体。 3.将MSCs经尾静脉输入胸腺损伤模型小鼠体内，观察指标包括:小鼠胸腺指数变化、外周血像变化、胸腺T淋巴细胞亚群变化、外周血T淋巴细胞亚群变化、CM-DiI标记的MSCs输注受照小鼠后在胸腺中的分布情况、胸腺Y染色体性别决定区(Sex-determining Region of Y-chromosome，Sry)基因的表达情况、免疫组化检测胸腺组织P53蛋白表达情况等。研究MSCs在受损胸腺中的定植情况、对胸腺功能的修复作用和机制。 4.根据MSCs在血液系统疾病中对免疫、造血方面的作用，对T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等疾病进行MSCs临床应用，为其临床实践做初步探讨。 研究结果： 1.体外分离、培养的小鼠骨髓MSCs在接种24小时后开始贴壁，起初多为小圆形或多角形，培养至第7天大多呈梭形，传代至第2代时细胞形态趋于统一，为长梭形细胞。流式细胞仪检测第2代MSCs的细胞表型，高表达CD44、CD105，低表达CD34、CD45。在定向诱导环境下，MSCs可以向成骨分化、向脂肪分化。 2.与对照组相比，三个不同剂量辐照组在辐照后各个时间点小鼠体重均下降。但6Gy辐照组只在辐照后第14天与对照组有统计学差异（P＜0.05），9Gy辐照组在第14、21天与对照组有统计学差异(P＜0.05)，12Gy辐照组在第14、21、28天与对照组均有统计学差异（P＜0.05）。三个辐照组在辐照后各个时间点的胸腺指数均低于对照组;9Gy与12Gy辐照组在第7、14、21、28天与对照组相比有差异(P＜0.05)，6Gy辐照组在第14、21、28天与对照组相比有差异(P＜0.05)。病理显示辐照组小鼠胸腺萎缩，皮质区淋巴细胞发生变性坏死，髓质区胸腺小体消失，辐照后第7天较明显，损伤程度与放射剂量呈正相关;照射后第14天，胸腺体积逐渐增大，胸腺细胞数量开始逐渐增加。12Gy照射组部分小鼠辐照后28天出现死亡。外周血变化方面，三个剂量辐照组白细胞数量和淋巴细胞数量在辐照后各个时间点上均低于对照组（P＜0.01）。辐照后，胸腺CD4+CD8+细胞下降幅度最大，至辐照后28天扔未恢复到辐照前水平。CD4-CD8-细胞在辐照后出现升高。CD4+CD8-和CD4-CD8+细胞比例在辐照后均下降。外周血T细胞亚群方面，辐照后辐照组CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞的比例和CD4/CD8比值则下降。辐照后胸腺和外周血T淋巴细胞亚群的变化趋势大致相同，随着辐照剂量增大，各亚群的变化幅度也随之增大。9Gy辐照组既能明显体现出胸腺损伤，又不至于辐照后出现严重并发症，所以选取9Gy辐照组作为胸腺放射性损伤模型。 3.MSCs输注对于受照小鼠胸腺损伤具有功能修复作用。治疗组与照射对照组在辐照后胸腺指数均有下降，治疗组优于照射对照组。治疗组和照射对照组在辐照后白细胞及淋巴细胞均有所下降，治疗组下降幅度低。 胸腺T细胞亚群检测发现，治疗组与照射对照组各亚群细胞的变化趋势大致相同，但是在治疗组中， CD4+CD8-细胞、CD4-CD8+细胞和CD4+CD8+细胞下降的幅度小于照射对照组。外周血T细胞亚群的变化与其相似。 CM-Dil标记MSCs输注后，在30天内可以在受者胸腺内找到MSCs定植的证据。另外在MSCs输注28天后，在雌性受体小鼠胸腺组织中仍能检测到雄性小鼠供体Sry。 免疫组化法观察到在小鼠受照后12小时，治疗组胸腺中P53蛋白表达明显少于对照组。 4.MSCs治疗皮肤T细胞淋巴瘤1例，效果明显。治疗骨髓增生异常综合症1例，可以改善造血功能。 结论： 1.通过percoll分离和贴壁筛选法，并改良培养条件后培养的细胞从形态、细胞表型及多向分化能力三个方面鉴定，是实验所需的骨髓间充质干细胞。 2.6Gy、9Gy、12Gy三个剂量均可引起小鼠胸腺的放射性损伤，但9Gy照射后胸腺改变较典型，且无其它严重并发症，所有小鼠可以安全存活30天以上，选择此剂量构建小鼠胸腺放射性损伤模型，可作为研究MSCs对胸腺功能修复作用的载体。 3.MSCs输注胸腺放射损伤小鼠后，可归巢至胸腺，参与胸腺的修复，减轻胸腺细胞的凋亡，调节T细胞亚群，对促进胸腺免疫重建有重要意义，可以作为长期放化疗、接受异基因造血干细胞移植后等免疫缺陷患者免疫重建的一个新手段。 4.MSCs应用于临床治疗相关血液病，安全性可靠，对治疗蕈样霉菌病等T细胞来源淋巴瘤、改善骨髓增生异常综合症-难治性贫血病人的造血功能有一定临床价值，值得进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 C57小鼠MSCs分离培养及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 构建小鼠胸腺放射性损伤模型

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第三部分 骨髓间充质干细胞对小鼠胸腺放射性损伤后功能修复作用的研究

1．材料和方法

2．结果

讨论

第四部分 间充质干细胞在血液系统疾病中治疗作用的初步实践

病例1：蕈样霉菌病(皮肤T细胞淋巴瘤)

病例2：骨髓增生异常综合症-RCMD

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

英文论文1

英文论文2