基于信号扩增策略构建的高灵敏荧光适体传感器用于检测腺苷

摘要

生物传感器是将目标物识别过程转换成信号并有效输出的一种快速检测和监控装置，其在许多领域有着广泛的应用，如药物分析、生物技术、环境保护和临床诊断等。适体的介入为传感器的研究发展提供了新的动力。由于其高特异性和高结合力的固有性质，以适体为识别元素的传感器成为近年来研究的热点。到目前为止，多种信号转导的适体传感器已经被建立，其中，荧光适体传感器因其仪器设备操作简单、灵敏度高、选择性好、响应快速、且对样品不会造成破坏等优点，得到广泛应用。本文的研究工作是利用生物化学分析的新技术构建新型的荧光适体传感器用于检测目标物。
　　腺苷是一种内源性核苷，同时也是重要的药物小分子，在生理和药理方面发挥着重要作用，如舒张血管、控制平滑肌收缩等，是人体生理活动的重要调节者。其在中枢神经系统、周围神经系统和免疫系统中均起着重要的作用。此外，据文献报道，腺苷还可作为癌症的潜在标志物。因此，腺苷的检测对心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤的诊断和治疗等方面都具有重要的意义[153-159]。
　　目前，大量的腺苷适体传感体系已被构建用于腺苷的分析检测，然而由于腺苷在正常人尿液和血清中含量极低，它们的灵敏度往往不够理想，不能直接用于复杂生物样本（人尿液和血清）中腺苷的定量检测（据报道正常人尿样中腺苷浓度范围在2.0×10-6molL-1到7.0×10-6mol L-1之间，血清中腺苷浓度范围在5.0×10-8mol L-1到1.0×10-7mol L-1之间）[176，178]。而生物样本中腺苷的检测在临床研究和疾病的诊断和预防方面具有较高的临床应用意义，例如生理条件下腺苷含量的波动可用于心、脑生理功能的研究，尿液中腺苷含量的升高可用于肿瘤的早期诊断。因此，如何提高传感器的灵敏度，并实现复杂生物样本中低腺苷含量的检测是目前腺苷检测面临的重要问题。本文利用高效的信号扩增策略，构建了新颖且通用的荧光适体传感器，使腺苷的灵敏度有了很大提高，并可达到生物样品中的定量检测。
　　本文第一章为绪论部分，首先对生物传感器进行了概述，并着重介绍了荧光适体传感器的特点、优势和应用前景;其次，对常用的信号扩增策略进行了概述;最后，介绍了腺苷检测的意义、现有方法、腺苷适体传感器及面临问题。
　　本文第二章，利用外切酶Ⅲ辅助的DNA循环和杂交链反应(HCR)的双重放大作用，构建了一种免标记且灵敏的荧光适体传感器用于检测腺菅。在该方案中，首先设计了一个包含催化链、适体链和链霉亲和素化磁球的三功能探针。当目标物被适体链识别之后，催化链会立即被释放。然后，催化链触发ExoⅢ辅助的DNA循环，产生大量的DNA片段，从而获得第一次放大。随后，DNA片段作为触发链引发HCR，形成带有许多G-四分体结构的双螺旋，获得了第二次放大。最终，荧光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)插入到G-四分体结构中，产生增强的荧光响应，实现了免标记的检测。该方法的检测限为4.2×10-7molL-1。此外，该方法特异性良好，并且能够区分癌症病人和正常人尿样中腺苷的含量，为腺苷的检测提供了一种新的可靠的定量方法。
　　虽然上述构建的适体传感器成功且灵敏的对腺苷进行了检测，但是，在实验过程中，为了获得低背景信号，我们引入了磁球对目标物进行富集和分离。然而，磁球的引入需要对其进行修饰、活化和分离，这无疑增加了操作上的复杂性和实验的成本。为此，我们展开了下一个工作，也就是本文的第三章，利用聚合切刻循环反应和发卡结构催化自组装（CHA）的双重扩增机制，构建了一种均相中检测腺苷的新方法。该方法设计了一个含有腺苷适体、切刻酶识别位点和CHA触发链互补碱基的发卡探针。当目标物存在时，适体识别腺苷使得发卡探针构象发生改变，在聚合酶、dNTPs和切刻酶的作用下，发生聚合切刻循环反应，产生大量单链DNA;此步为第一次扩增;然后，单链DNA作为CHA的引物链，触发CHA生成大量带有G-四分体的双链DNA，此步为第二次扩增;最终插入荧光染料NMM，实现荧光信号的免标记检测，检测限达到1.3×10-7mol L-1。该检测限比其他检测腺苷的免标记方法降低了两个数量级[171，175]，较本课题组降低了约50倍[148]。该方法可实现均相中免标记、免分离且双重放大的腺苷检测，同样能区分癌症病人和正常人尿样中腺苷的含量，且比之本文第二章，灵敏度有了进一步的提高，在均相中进行操作使得方法更加简便且耗时短。此外，通过对发卡探针设计中适体序列部分的改变，该体系还可以拓展应用于其他目标物的检测，具有很强的通用性。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 荧光适体传感器

1．2．1 适体(目标识别元素)

1．2．2 荧光(信号输出方式)

1．2．3 荧光适体传感器的现状

1．3 信号扩增策略

1．3．1 酶介导的核酸扩增技术

1．3．2 基于DNA纳米结构的扩增技术

1．4 腺苷

1．4．1 腺苷的检测意义

1．4．2 腺苷的传统检测方法

1．4．3 腺苷的适体传感器

1．4．4 腺苷面临的问题

1．5 本论文的研究内容

第二章 基于外切酶Ⅲ辅助的DNA循环和杂交链反应构建的免标记双重放大的腺苷传感器

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器与装置

2．3 实验步骤

2．3．1 高温高压灭菌

2．3．2 链霉亲和素化磁球-探针的制备

2．3．3 Exo Ⅲ辅助的DNA循环和HCR

2．3．4 插入染料及荧光测量

2．4 腺苷适体传感器的设计原理

2．5 结果与讨论

2．5．1 体系的荧光图谱及设计的可行性

2．5．2 HCR中序列设计的优化

2．5．3 反应条件的优化

2．5．4 适体传感器的分析检测

2．5．5 适体传感器的方法学验证

2．5．6 实际尿样分析

2．6 结论

第三章 基于聚合切刻循环和发卡结构催化自组装构建的免标记荧光适体传感器用于检测腺苷

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与装置

3．3 实验步骤

3．3．1 高温高压灭菌

3．3．2 实验方法

3．3．3 CHA过程的凝胶电泳实验

3．4 腺苷适体传感器的设计原理

3．4．1 实验原理的设计

3．4．2 发卡结构HP、H1和H2的设计

3．4．3 CHA过程的电泳验证

3．5 结果与讨论

3．5．1 整体实验的荧光图谱

3．5．2 发卡探针HP序列设计的优化

3．5．3 反应条件的优化

3．5．4 适体传感器的分析检测

3．5．5 适体传感器的方法学验证

3．5．6 实际尿样分析

3．5．7 与现有方法的比较

3．6 结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文