A549细胞中TrkB激活的调控机制研究

摘要

目的：
　　1，探讨STAT3活性是否参与A549中TrkB的激活。
　　2，探讨BDNF-TrkB信号是否影响STAT3活性及下游信号。
　　方法：
　　1.细胞培养与处理
　　人类的肺腺癌细胞系A549用Dulbecco's modified Eagle's培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)加入10％胎牛血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺，培养在37℃，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中。
　　2.蛋白免疫印迹(WB)
　　通过免疫印迹测定目的蛋白质的含量。简言之，等量的蛋白质（10μg/每个上样孔）被SDS-PAGE电泳分离并转移到0.22um PVDF膜上(Bio-Rad Inc.)。将膜孵育在封闭液中(0.2mM Tris，137mM Nacl，5％脱脂牛奶以及0.1％Tween-20)一个小时，然后放在4℃抗体中过夜。用TBST缓冲液(0.1％ Tween-20，0.2mM Tris，137mM NaCl)冲洗PVDF膜后，在室温下孵育HRP-结合的二抗(1∶5000)一个小时，然后进行ECL化学发光检测。
　　3.实时定量PCR反应
　　脑源性神经营养因子的合成是通过定量RT-PCR来衡量的。细胞用PBS冲洗后，提取RNA。根据操作说明用TRNzol-A+RNA提取试剂(TIANGEN)提取总RNA。逆转录1μg的总RNA和RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Fermentas)。实时定量PCR使用SYBR GREEN(Roche)进行(MyiQ2Bio-Rad)检测。用2-△△CT方法将每个孔的BDNFmRNA水平标准化。每个实验重复三次。
　　4.统计分析
　　显著性差异统计使用T检验和方差分析（方差分析）方法。数据显示用mean±SEM表示，p＜0.05被认为是有显著变化的。所有的实验都重复三次。
　　结果：
　　1.TrkB在人类肺癌细胞株A549中表达，并存在组成型激活
　　为了检测TrkB的表达和激活，本实验用免疫印迹分析(WB)检测不同条件下A549细胞裂解液。分别用pan-TrkB抗体检测TrkB蛋白表达，用phospho-Trk抗体检测激活的TrkB。在肺癌细胞中加入BDNF刺激1h作为阳性对照。结果显示，TrkB在A549细胞中存在表达和组成型激活。在A549细胞中，只有145kD的TrkB-FL亚型的表达，没有TrkB.T1的表达。我们发现，在A549细胞无血清饥饿1h后TrkB磷酸化水平显著降低，而A549细胞无血清饥饿24小时后TrkB的磷酸化水平又恢复到饥饿前水平。在血清饥饿的条件下TrkB的磷酸化可以自发恢复，提示我们可能有配体BDNF自分泌机制的存在。为了确认这种可能性，我们检测在A549细胞中是否存在BDNF的表达。结果表明A549存在内源性BDNF的表达。这一发现证明了在A549细胞中BDNF作为主要因素激活TrkB。
　　2.在A549细胞中STAT3转录因子是BDNF表达的主要影响分子
　　为了研究在无血清的条件下STAT3是否激活，我们进行了免疫印迹分析法测定STAT3磷酸化水平。在A549细胞中，存在Stat3酪氨酸磷酸化以及丝氨酸磷酸化，1h的血清饥饿可以降低STAT3的磷酸化，但24h血清饥饿后，STAT3的磷酸化水平与对照组相比都升高。和Stat3酪氨酸磷酸化相一致的是，特异性的STAT3抑制剂——Sattic预处理A549，脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平都显著降低。在无血清条件下，Star3活性被Sattic抑制能阻断A549细胞中BDNF在血清饥饿后的自发恢复。结果提示我们，在A549细胞中STAT3影响BDNF的表达。
　　3.在A549细胞中BDNF是Stat3活性的一个重要的调节因子
　　据先前的研究报道，STAT3同时是BDNF及其受体TrkB的下游信号目标。在A549细胞中，为了研究STAT3活性是否也受BDNF及其受体TrkB调节，在细胞水平，我们检测了存在Trk的抑制剂K252a时，STAT3的磷酸化水平。结果表明，阻断TrkB活性通路可以显著减少STAT3的磷酸化水平;而更多的脑源性神经营养因子可能进一步激活STAT3。为了检测在A549细胞中无血清条件下，STAT3活性的恢复是否依赖BDNF;我们在无血清条件下加入K252a后处理12 h;此时A549细胞被检测出STAT3的磷酸化水平低于没有加入K252a情况。结果表明，A549细胞在无血清条件下阻断TrkB活性可能放缓STAT3的自发恢复。这一发现强烈提示，在A549细胞中BDNF增强STAT3活性。
　　4.STAT3诱导的BDNF表达参与Akt蛋白激酶的激活
　　为了检验是否STAT3诱导BDNF表达与TrkB及其下游信号通路激活有关，我们检测了STAT3抑制剂是否影响AKT的活性。AKT是当细胞暴露于凋亡刺激下，重要的反应蛋白之一。我们分别加入K252a和Satic抑制剂处理细胞，然后我们检测Akt蛋白激酶的磷酸化水平。如图所示，再加入Sattic或K252a处理后，细胞中Akt磷酸化水平减少。结果表明，BDNF/TrkB和STAT3活性都与Akt蛋白激酶的激活相关。更重要的是，外源加入K252a不能进一步降低Sattic处理的细胞中Akt蛋白激酶的磷酸化水平。这些结果证明了STAT3诱导的BDNF表达参与Akt蛋白激酶的激活。
　　结论：
　　肺癌是目前全球恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一。在所有肺癌中，非小细胞肺癌(NSCLC)占到80％。而且NSCLC的发病率几年来仍在上升。非小细胞肺癌往往对现有化疗药物不敏感，因此进一步了解哪些分子参与了非小细胞肺癌的发生发展调控，具有重要的价值。
　　脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养素超家族一员，在神经系统的结构和功能研究中，都显示出重要功能。最近，一些研究表明，脑源性神经营养因子及其受体TrkB可能参与一些恶性肿瘤的生长和转移，如神经母细胞瘤、胰腺导管癌、前列腺癌、肝细胞癌和肺癌等。然而目前在非小细胞肺癌中如何引起TrkB下游信号激活的分子机制尚不清楚。
　　本研究以非小细胞肺癌中常见的细胞模型——A549细胞为主要研究材料，研究了非小细胞肺癌中，BDNF激活及调控的机制。本研究主要有以下三个方面的发现:
　　首先，本研究发现A549中TrkB的激活可以依赖其自分泌的BDNF实现，而不是依赖微环境中旁分泌的BDNF。而且表明这种BDNF的自分泌调控，依赖STAT3的活性。以往研究显示，在非小细胞肺癌中，存在TrkB表达的增加，以及外源加入BDNF可以增加TrkB的活性，及影响下游功能，但没有研究体内情况下，TrkB的激活所需的配体从何而来。本实验通过RT-PCR及WB实验，证明A549细胞中，存在BDNF的内源性表达，而且这种内源性表达的BDNF参与了TrkB活性的调控。研究显示，A549细胞内，BDNF的调控受到STAT3的调控。STAT3在多种肿瘤调控中起到关键的作用，并且已经被报道参与了肺癌的发生发展。我们的研究显示，抑制STAT3的活性，可以显著减少BDNF的合成，提示STAT3是BDNF合成分泌重要的调控因子。
　　第二，本研究发现BDNF/TrkB信号可以进一步上调STAT3的活性，而这种上调进一步增加了BDNF的表达及分泌，以及TrkB的激活。我们研究发现，不仅STAT3可以调控BDNF的合成，BDNF/TrkB活性可以反过来调控STAT3的活性。而这种BDNF引起的STAT3活性上调，进一步促进了BDNF的合成释放。这形成了一个典型的正反馈调控，可能是导致肺癌细胞中STAT3及TrkB活性大量增强的原因之一。
　　第三，本研究发现这种STAT3依赖BDNF分泌的正反馈调控，影响了A549细胞中PI3K-AKT信号通路的激活。结果显示，在A549中，阻断STAT3可以引起AKT磷酸化水平的下降，而这种下降不会因为Trk活性的抑制而更低。提示了STAT3对于AKT的活性调控，可能是由于对BDNF合成的调控所引起的。也就是说，STAT3依赖的BDNF分泌的正反馈调控，影响了A549细胞中PI3K-AKT信号通路的激活。
　　意义:
　　在本研究中，发现A549细胞中，BDNF以自分泌方式调控TrkB激活，并且存在正反馈回路:STAT3信号的激活，促进BDNF产生，激活TrkB信号，而TrkB的激活又进一步促进STAT3的活性，从而促进BDNF的合成、释放以及TrkB及其下游信号的激活。这种A549细胞自分泌BDNF反馈循环可能参与了A549生物功能调控。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

表皮生长因子受体在肺癌发生发展中的作用

血管内皮细胞生长因子在肺癌发生发展中的作用

MAPK激酶磷酸酶在肺癌发生发展中的作用

过氧化物酶体增殖物激活受体在肺癌发生发展中的作用

基质金属蛋白酶在肺癌发生发展中的作用

晚期糖基化终末产物受体在肺癌发生发展中的作用

实验材料

1．细胞系

2．实验试剂

3．主要溶剂及试剂配方

4．主要仪器设备及耗材

实验方法

1．细胞培养与处理

2．蛋白免疫印迹(WB)

3．实时定量PCR反应

4．统计分析

实验结果

1．TrkB在人类肺癌细胞株A549中表达，并存在组成性激活

2．在A549细胞中STAT3转录因子是BDNF表达的主要影响分子

3．在A549细胞中BDNF是Stat3活性的一个重要的调节因子

4．STAT3诱导BDNF表达参与AKT蛋白激酶的激活

附图

讨论

参考文献

致谢

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