胸腺免疫抑制五肽TIPP的抗哮喘气道炎症作用及其机制研究

摘要

目的：
　　哮喘是由多种细胞（包括气道的炎症和结构细胞）和炎症介质参与的气道慢性炎症性疾病，气道炎症是其发病机制的基础和核心。哮喘患病率高，在各个年龄阶段的人群均可发病，已成为全球关注的公众卫生问题。哮喘不能根治，只能通过药物进行控制。现在治疗哮喘最常用的药物是糖皮质激素，对于严重哮喘患者长期吸入激素会产生局部或全身毒副反应，因此研究开发治疗效果好、毒副作用小的抗哮喘药具有重要意义。
　　本项目组长期从事胸腺来源的免疫抑制组分——胸腺免疫抑制提取物(TISE)的研究。TISE是内源性的淋巴细胞生长抑制物，在体内外均可以有效地抑制免疫反应和变态反应。研究表明TISE能显著抑制小鼠迟发型超敏反应和大鼠被动皮肤过敏反应，显著延长大鼠移植皮肤的存活期，并对OVA刺激致敏豚鼠哮喘的发生有显著的抑制作用。将低分子量的TISE通过微球菌核酸酶降解、酸水解及反相高效液相色谱分离相结合的方法进行进一步的分离纯化，最终得到一个分子量为604.68 Da的五肽，其序列为Ala-Glu-Trp-Cys-Pro，并将其命名为胸腺免疫抑制五肽(thymic immunosuppressive pentapeptide，TIPP)。鉴于TISE体内外均有显著的抗炎抗变态反应的作用，TIPP是由TISE中分离纯化得到的，我们推测TIPP可能也具有抗过敏和抗变态反应炎症的作用，并能用于哮喘的治疗。为证实这个推测，我们首先对TIPP体内抗哮喘气道炎症活性进行研究，从组织水平、细胞水平、分子水平等各个方面评价TIPP对哮喘动物模型的治疗作用及毒副作用;利用体外肥大细胞激活实验检测TIPP的体外抗过敏活性及作用机制，结合蛋白芯片实验寻找相关的TIPP作用蛋白;因TIPP是一新发现的具有全新序列的五肽，对TIPP活性及其结构之间的关系进行初步考察。本研究有可能发现一个治疗过敏性疾病的新机制，并为TIPP这一新的五肽的深入开发奠定基础，因此本项目研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
　　方法：
　　1.TIPP体外免疫抑制活性及TIPP结构与活性关系的研究
　　首先用脾淋巴细胞检测TIPP的细胞毒性、TIPP对不同丝裂原刺激的脾淋巴细胞增殖的抑制作用及TIPP对LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬细胞吞噬活性的影响，并对TIPP与3种衍生物(D-Glu2)-TIPP、[Ala(Ac)1]-TIPP及(Ser4)-TIPP的免疫抑制活性进行比较。
　　2.TIPP体内抗哮喘气道炎症作用研究
　　采用五周龄雌性BALB/c小鼠于第0、7、14天进行卵清蛋白(OVA)致敏并于第28-33天用OVA经鼻刺激，建立小鼠过敏性哮喘模型。于最后一次激发24 h后，取血测定外周血白细胞(WBC)分型;取血清及肺泡灌洗液(BALF)，测定血清中OVA特异性IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;流式细胞技术检测BALF中不同免疫细胞亚型比例的改变;HE及PAS染色检测小鼠肺部炎症细胞浸润及支气管周杯状细胞增生情况;实时定量荧光PCR技术检测小鼠肺组织中细胞因子的转录水平;Western blot方法检测小鼠肺组织炎症相关蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表达水平，并检测炎症相关信号通路蛋白丝裂原激活蛋白激酶MAPKs及核转录因子NF-κB的激活情况。同时采用豚鼠气管环实验检测TIPP对组胺、乙酰甲胆碱刺激的气管平滑肌收缩的影响。
　　3.TIPP体外抗过敏活性及机制研究
　　采用抗原DNP-HSA对anti-DNP-IgE致敏的RBL-2H3细胞进行刺激，检测TIPP对IgE-抗原复合物刺激的RBL-2H3细胞激活的影响。主要包括:检测细胞培养上清中β-氨基己糖苷酶活性及组胺含量，分析TIPP对脱颗粒的影响;用Ca2+荧光探针Fluo3-AM检测TIPP对激活的RBL-2H3细胞内Ca2+水平的影响;实时荧光定量PCR技术检测TIPP对IgE介导RBL-2H3细胞激活时相关炎症因子mRNA水平的影响;用罗丹明标记的鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白F-actin，激光共聚焦显微镜检测TIPP对IgE-抗原复合物刺激RBL-2H3细胞激活时膜波动的影响;Western blot方法检测TIPP对IgE-抗原复合物刺激RBL-2H3细胞激活时COX-2的表达水平、信号通路相关蛋白及核转录因子NF-κB激活的影响。
　　4.寻找TIPP靶点
　　采用激光共聚焦显微镜观察TIPP与RBL-2H3细胞的结合情况，并用流式细胞技术分析TIPP浓度、作用时间、孵育温度对TIPP与RBL-2H3细胞的结合的影响。用生物素标记TIPP，采用HuProtTM人类蛋白质组芯片检测与TIPP有相互作用的蛋白质，结合之前实验结果，推测TIPP可能作用靶点。并检测TIPP对K562细胞（Bcr-Abl阳性表达）和HL60细胞（Bcr-Abl阴性表达）增殖的抑制作用。
　　结果：
　　1.TIPP具有免疫抑制活性且活性与结构相关
　　TIPP对Con A及LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞的增殖均有抑制作用，但对ConA刺激的小鼠脾淋巴T细胞增殖的抑制作用更为显著，并能抑制因LPS刺激引起的小鼠RAW264.7细胞的吞噬能力的增强。TIPP对未加丝裂原刺激的小鼠脾淋巴细胞及RAW264.7细胞的细胞生存率没有影响，即TIPP没有细胞毒性，其对Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞的增殖及LPS刺激引起的小鼠RAW264.7细胞吞噬能力增强的抑制作用并不是因其毒性作用产生的。TIPP免疫抑制活性的发挥与其自身的结构相关，但其Cys4的-SH基团对TIPP抑制活性的发挥起一定的增强作用。当TIPP的-SH变为-OH时，其活性降低显著。
　　2.TIPP能显著抑制哮喘小鼠肺部炎症的发生
　　TIPP可以显著抑制哮喘小鼠肺部炎症的发生，体内给药毒副作用小。TIPP显著降低哮喘小鼠BALF中细胞总数并能有效抑制BALF中不同亚型细胞比例的改变;组织切片分析表明TIPP对哮喘小鼠肺部炎症细胞浸润及支气管周杯状细胞增生有抑制作用;TIPP可有效抑制哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE的水平和BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平，并能显著抑制肺组织中炎症因子IL-4、TNF-α及eotaxin-1 mRNA的转录水平;Western blot结果显示TIPP可有效地抑制哮喘小鼠肺组织炎症相关蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表达水平，并能有效抑制炎症相关信号通路蛋白MAPKs及核转录因子NF-κB激活。豚鼠气管环实验结果表明，TIPP对乙酰甲胆碱及组胺引起的气管平滑肌的收缩并没有直接的抑制作用，即TIPP抗哮喘作用的发挥并不是直接的支气管舒张作用，而是依赖于其抗炎活性。
　　3.TIPP抑制Raf/MEK/ERK信号通路及NF-κB的核移位
　　TIPP主要作用于抗原刺激阶段，可显著抑制因抗原DNP-HSA刺激的致敏RBL-2H3细胞激活引起的脱颗粒，抑制因抗原刺激导致的RBL-2H3细胞内Ca2+水平的增高和膜波动的发生，对抗原刺激引起的细胞内相关炎症因子IL-3、IL-4、IL-6、IL-13、TNF-α及MCP-1 mRNA转录有抑制作用，并能抑制COX-2蛋白的表达。Western blot分析TIPP的作用机制，结果表明TIPP可显著抑制Raf/MEK/ERK信号通路及NF-κB的核移位，而对JNK、p38、AKT的激活没有影响。
　　4.生长因子受体结合蛋白Grb2是TIPP的可能作用靶点
　　激光共聚焦显微镜观察发现TIPP可以与RBL-2H3细胞的细胞膜结合，并能进入细胞内;流式细胞技术检测发现TIPP与RBL-2H3细胞的结合具有浓度、时间、温度依赖性;HuProtTM人类蛋白质组芯片检测发现TIPP与生长因子受体结合蛋白Grb2有特异性相互作用，其荧光信号值（扣除背景值后）达1187.500±27.577，信噪比SNR为26.159±0.998。Raf/MEK/ERK是Ras下游信号通路，而Grb2又是Ras激活所需的重要衔接蛋白，因此我们推测TIPP可能是Ras信号通路上游重要衔接蛋白Grb2的阻断剂，TIPP通过与Grb2蛋白的SH2或SH3结构域结合，阻断其与上游酪氨酸激酶LAT酪氨酸磷酸化位点或与下游SOS蛋白的结合，阻断了Ras信号通路的激活，从而发挥其抗炎抗过敏作用的。此外，与HL60细胞（Bcr-Abl阴性表达）相比，TIPP对Bcr-Abl阳性表达细胞K562增殖的抑制作用更为显著，能将其阻滞在G2期。TIPP对K562细胞的增殖表现出更明显的抑制活性，这与TIPP是Grb2阻断剂这一假设符合。
　　结论：
　　(1)首次对胸腺免疫抑制五肽TIPP的免疫抑制活性进行了研究。TIPP对Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞的增殖及LPS刺激的小鼠RAW264.7吞噬能力的增强均有抑制作用，且无细胞毒性。
　　(2)对TIPP活性与结构关系进行了初探。TIPP活性的发挥与其自身的结构相关，但其Cys4的-SH基团对TIPP抑制活性的发挥起一定的增强作用。
　　(3)首次对TIPP体内抗哮喘气道炎症作用进行了研究。TIPP可有效的抑制哮喘小鼠肺部炎症的发生，且体内给药毒副作用小。
　　(4)首次对TIPP体外抗过敏活性进行了研究。TIPP可以有效地抑制IgE-抗原复合物刺激的RBL-2H3细胞的激活。
　　(5)首次对TIPP作用机制进行了研究。TIPP可以抑制Raf/MEK/ERK信号通路的激活及NF-κB的核移位，抑制IgE-抗原复合物刺激的RBL-2H3细胞的激活。TIPP可能是Grb2的阻断剂，通过与Grb2蛋白结合，阻断了Ras信号通路的激活，从而发挥其抗炎抗过敏作用的。
　　(6)对TIPP是Grb2阻断剂这一机制进行初步验证。与Bcr-Abl阴性表达细胞HL60相比，TIPP对Bcr-Abl阳性表达细胞K562增殖的抑制作用更为显著，能将其阻滞在G2期。TIPP对K562细胞的增殖表现出更明显的抑制活性，这与TIPP是Grb2阻断剂这一假设符合。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1 哮喘的发病机制、相关细胞与气道重塑

1．1 哮喘的发病机制

1．2 哮喘相关细胞

1．3 气道重塑

2 哮喘治疗药物

2．1 糖皮质激素

2．2 β2肾上腺素受体激动剂

2．3 抗IgE抗体

2．4 其它哮喘治疗药物

3 胸腺免疫抑制五肽(TIPP)

3．1 抑素的发现与起源

3．2 胸腺抑素

3．3 胸腺免疫抑制提取物(TISE)

3．4 胸腺免疫抑制五肽(TIPP)

4．本课题设计思路及拟解决问题研究

第二章 TIPP体外免疫抑制活性研究

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 实验动物

1．3 细胞株

1．4 仪器设备

1．5 溶液配制

2 实验方法

2．1 TIPP对小鼠脾淋巴细胞的影响

2．2 TIPP对RAW264．7细胞的影响

2．3 TIPP及其衍生物活性研究

3 实验结果

3．1 TIPP对小鼠脾淋巴细胞的影响

3．2 TIPP对RAW264．7细胞的影响

3．3 TIPP及其衍生物活性研究

4 讨论

5 结论

第三章 TIPP体内抗哮喘气道炎症作用研究

1 实验材料

1．1 试剂

1．2 实验动物

1．3 仪器设备

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 小鼠哮喘模型的建立

2．2 流式细胞技术检测TIPP对OVA刺激的致敏小鼠脾淋巴细胞激活的影响

2．3 样品收集

2．4 流式细胞技术分析BALF细胞分型

2．5 HE、PAS染色

2．6 ELISA检测

2．7 实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织中细胞因子mRNA水平

2．8 Western blot检测TIPP对小鼠肺组织中炎症相关蛋白表达及信号通路蛋白激活的影响

2．9 TIPP对组胺、mAch刺激的豚鼠气管平滑肌收缩的影响

3 实验结果

3．1 流式细胞技术检测TIPP对OVA刺激的致敏小鼠脾淋巴细胞激活的影响

3．2 TIPP对小鼠体重、胸腺指数、脾脏指数及肺指数的影响

3．3 TIPP对哮喘小鼠WBC分型的影响

3．4 TIPP对哮喘小鼠BALF细胞的影响

3．5 HE及PAS染色分析

3．6 TIPP对哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE水平的影响

3．7 TIPP对哮喘小鼠BALF中细胞因子水平的影响

3．8 TIPP对哮喘小鼠肺组织中细胞因子转录水平的影响

3．9 Western blot分析

4 讨论

5 结论

第四章 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞激活的抑制作用

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 细胞株

1．3 设备仪器

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 RBL-2H3细胞培养

2．2 TIPP对RBL-2H3细胞存活率的影响

2．3 IgE介导的RBL-2H3细胞激活最适条件摸索

2．4 TIPP作用阶段检测

2．5 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞组胺释放的影响

2．6 细胞内Ca2+水平测定

2．7 实时荧光定量PCR检测细胞因子转录水平

2．8 激光共聚焦显微镜检测

2．9 Western blot检测

2．10 -SH基团对TIPP抑制RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

3实验结果

3．1 TIPP对RBL-2H3细胞存活率的影响

3．2 IgE介导的RBL-2H3细胞激活最适条件确定

3．3 TIPP作用阶段

3．4 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞激活时组胺释放量的影响

3．5 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞激活时细胞内Ca2+水平的影响

3．6 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞激活时细胞因子转录的影响

3．7 TIPP对IgE介导的RBL-2H3细胞激活时膜波动的影响

3．8 Western blot分析

3．9 -SH基团对TIPP抑制RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

4 讨论

5 结论

第五章 TIPP作用靶点寻找

1 实验材料

1．1 试剂与材料

1．2 细胞株

1．3 设备仪器

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 TIPP与RBL-2H3细胞相互作用检测

2．2 HuProtTM人类蛋白质组芯片检测TIPP相互作用蛋白

2．3 基于Grb2阻断剂机制初步活性验证

3 实验结果

3．1 TIPP与RBL-2H3细胞相互作用模式

3．2 HuProtTM人类蛋白质组芯片检测TIPP相互作用蛋白

3．3 基于Grb2阻断剂机制初步活性验证

4 讨论

5 结论

总结与展望

1 全文总结

2 创新点

3 展望

参考文献

Article 1

Article 2

Article 3

致谢

博士期间发表的论文