弓形虫棒状体蛋白ROP5和ROP7的DNA疫苗免疫小鼠诱导的保护性研究

摘要

刚地弓形虫是一种属于顶复门的细胞内寄生原虫，呈现世界性分布，能导致人兽共患寄生虫病的发生。大多数人感染弓形虫时通常没有症状，但在免疫抑制和免疫缺陷个体中，如艾滋病病人、器官移植、长期接受化疗的恶性肿瘤患者可能会导致严重的后果。孕妇感染可引起流产、畸胎、死胎和胎儿失明等。动物感染弓形虫给畜牧业也带来了巨大的经济损失。由于目前尚无治疗弓形虫病的特效疗法，所以开发有效的弓形虫疫苗显得尤为重要。本研究中我们选取了ROP5和ROP7两种候选基因以构建复合DNA疫苗。
　　目的:研究目的是探索ROP5/ROP7基因对BALB/c小鼠弓形虫感染的免疫保护性。
　　方法:根据GenBank发表的弓形虫ROP5和ROP7序列设计合成引物，通过PCR扩增获取ROP5和ROP7基因。采用亚克隆技术将两基因分别克隆至真核表达载体pBudCE4.1，分别构建能表达ROP5和ROP7的重组真核表达载体pBudCE4.1-ROP5(pROP5), pBudCE4.1-pROP7(pROP7)和pBudCE4.1-ROP5/ROP7(pROP5/ROP7)，并对它们进行酶切鉴定。将重组质粒转染HEK293-T细胞，经Western blot分析鉴定后，大量提取重组质粒用于免疫小鼠。动物实验通过ELISA检测免疫小鼠血清特异IgG水平和细胞因子并观察弓形虫感染小鼠后的存活时间评价其免疫保护力。
　　结果:PCR扩增出1，650 bp和1，728 bp大小的目的基因片段，ROP5和ROP7两个基因成功连接到同一个表达载体pBudCE4.1上并且能在HEK293T细胞中表达。Western blot分析，可检测到ROP5和ROP7蛋白的表达。复合基因免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体。在动物试验中，复合基因疫苗免疫的小鼠生存时间较其它组小鼠显著延长，复合基因疫苗免疫小鼠中抗弓形虫IgG、IgG2a的抗体水平均高于其它组(P＜0.05)。在细胞因子检测中，双基因疫苗免疫的小鼠表现出更高水平的IFN-γ（P＜0.05），而各组间IL-4和IL-10水平无显著性差异(P＞0.05)。
　　结论:我们的研究结果表明，构建的基因疫苗对弓形虫的感染有一定的免疫保护作用且复合基因疫苗优于单基因疫苗。本研究为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 弓形虫棒状体蛋白ROP5和ROP7的DNA疫苗的构建及鉴定

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分 弓形虫ROP5和ROP7的DNA疫苗对小鼠的免疫效应研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论著