人凝血因子Ⅷ生产环节中的近红外定量分析研究

摘要

人凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ，FⅧ)是治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状等的不可或缺的药品，但我国当前整个血液制品行业长期处于供不应足的状态，因此提高产品的活性收率以及比活性是解决现状的一个必要举措。国内FⅧ的生产过程多采用离子交换层析法，从人血浆冷沉淀中分离纯化FⅧ，包括酸沉淀、A50吸附、S/D灭活、层析、超滤、冻干等主要环节，由于缺乏很好的过程控制方法，导致产品收率低、比活低。因此，有必要针对生产现状，将现代过程分析与控制技术引入到FⅧ生产过程中的关键环节当中，增加对生产工艺过程的了解，有效控制工艺过程，提升FⅧ的收率及比活性。近红外光谱分析技术(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)是当前最重要的一种过程分析技术（Process Analytical Technology，PAT），具有快速准确无损等优势，在制药行业中已有较为广泛的应用，在血液制品中的应用也有研究。
　　本课题选取FⅧ生产过程中的酸沉淀、层析洗脱和冻干环节为研究对象，采用NIRS结合不同的化学计量学方法，尝试建立了针对FⅧ比活性、效价以及水分的定量分析模型，为其在线应用奠定了基础。
　　具体研究内容如下:
　　1.FⅧ酸沉淀过程分析和近红外定量模型的建立
　　本实验考察了人凝血因子Ⅷ生产过程中酸沉淀终点控制方法的合理性，然后用近红外光谱分析技术建立了FⅧ比活性的偏最小二乘(partial least squares，PLS)定量分析模型，选取了测定过一级数据的108个样品光谱参与建模，其中随机选取6次试验的64个样品划入校正集，另外4次试验的44个样品划入验证集，通过对校正集样品和验证集样品的含量分布以及主成分得分图进行分析，证明分类结果比较理想，满足样品集的划分要求。通过对校正集样品的统计分析，将杠杆值或学生化残差值过高的样品进行判断，若确为异常样品则予以剔除。在光谱测量过程中不可避免地会引入噪声和产生基线漂移，在建立校正模型前有必要对光谱进行适当的预处理，微分可以有效消除基线的漂移，放大信号差异，平滑多与微分联用，可有效提高信噪比，标准化(Autoscale)可以赋予光谱中所有波长的变量相同的权重，凸显样品光谱的差异，最终选择这3种预处理方法——一阶微分+SG13点平滑+标准化，采用处理后的光谱数据建立PLS校正模型，模型的各项参数较为理想，Rc=0.9649，Rp=0.9229，RMSEC=0.0576，RMSEP=0.0493。对建立好的模型进行预测精密度的考察，在验证集样品中随机选取3个样品，包含不同的FⅧ比活性值，重复测量6次光谱，然后采用建立的模型通过采集光谱得到样品的预测值，经计算预测值的相对标准偏差在5％左右，且随着比活的升高而减小，证明此分析方法具有较好的重复性，可用于未知样品的预测。
　　2.人凝血因子Ⅷ层析过程中洗脱液效价的近红外定量分析研究
　　本实验建立了FⅧ层析过程中洗脱液FⅧ效价的定量模型。层析洗脱过程获得了68个样品，FⅧ效价分布比较均匀，符合样品集的要求，且不存在显著异常点。比较不同方法的PLS建模结果可知，选择中心化(Meancenter)+基因算法（Genetic algorithm，GA）所建立的PLS模型R2为0.9010、RMSEP为0.4090，既有较高的线性，也降低了预测误差，它是所使用的最佳PLS建模方法。而采用ANN、SVM方法建立模型，其结果表明采用sigmoid传输函数的BP-ANN建模方法的R2=0.942，RMSEC=0.3754，RMSEP=0.4272，是所有方法中最佳的建模方式。这可能是因为FⅧ的效价是物质的活性信息，较为复杂，与物质的浓度不成定量线性关系，所以采用非线性的回归方法能够得到更好的建模结果。应用近红外光谱分析技术和此定量模型，可以在FⅧ层析洗脱过程中针对FⅧ效价进行特异性监测，从而更准确的控制收集洗脱液的起点和终点。
　　3.人凝血因子Ⅷ冷冻干燥过程中水分含量的近红外定量分析研究
　　本实验利用近红外光谱和相关的化学计量学建立了FⅧ冻干过程中水分含量的定量检测模型，通过考察不同的预处理方法和光谱区间选择方法，最终确定了正交信号校正(OSC)结合二阶导数加SG平滑的预处理方法，以及GA作为谱区选择方法。所建立模型的主要参数为R2=0.918，RMSEC=0.2141，RMSECV=0.4102，RMSEP=0.3848，均处于可以接受的范围内。通过验证，模型的线性、分辨能力、准确度和精密度等均符合要求，证明了该模型的实用性与有效性。该模型的建立，是实现在线监测冻干过程中FⅧ制剂水分含量变化的坚实基础，一旦在线监测系统得以实现，冻干时间将得到极大的优化，避免因冻干时间过长造成的FⅧ活性损失，而利用光纤进行多点监控，可以保证整批产品的水分含量都达到标准，使不合格产品的数量达到最低。
　　本论文的创新点有:
　　本研究首次将近红外光谱分析技术应用于人凝血因子Ⅷ的生产过程研究，分别建立了酸沉淀过程中FⅧ比活性的PLS定量模型、层析过程中洗脱液FⅧ效价的定量分析模型和冻干过程中水分含量变化的定量分析模型。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1 凝血因子Ⅷ简介

1．1 凝血因子Ⅷ的结构和功能

1．2 凝血因子Ⅷ的生产过程

1．3 凝血因子Ⅷ生产过程中的检测方法

2 近红外光谱分析技术简介

2．1 过程分析技术简介

2．2 近红外光谱分析技术原理及特点

2．3 近红外光谱分析技术在制药领域的应用规范

2．4 近红外光谱分析技术在制药领域的应用

3 本课题的主要研究内容

第二章 人凝血因子Ⅷ酸沉淀过程分析和近红外定量模型的建立

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 样品的制备

2．2 近红外光谱的采集

2．3 FⅧ效价的测定

2．4 总蛋白含量的测定

2．5 数据处理

3 实验结果

3．1 FⅧ效价的测定

3．2 蛋白质浓度的测定

3．3 FⅧ比活性的变化情况

3．4 近红外定量模型的建立

4 结论与讨论

第三章 人凝血因子Ⅷ层析过程中洗脱液效价的近红外定量分析研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器与软件

2．方法

2．1 样品的制备

2．2 近红外光谱的采集

2．3 FⅧ效价的测定

2．4 近红外光谱模型建立与优化

3 结果

3．1 样品的FⅧ效价

3．2 样品的近红外光谱

3．3 校正集和验证集的划分

3．4 异常点的剔除

3．5 模型建立与评价

4 结论与讨论

第四章 人凝血因子Ⅷ冷冻干燥过程中水分含量的近红外定量分析研究

1 材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 方法

2．1 样品的制备

2．2 光谱的采集

2．3 水分含量的测定

2．4 建立校正模型

2．5 模型的评价

3 结果

3．1 样品制备及水分含量测定结果

3．2 样品的近红外光谱

3．3 校正集样品和验证集样品的选择

3．4 异常样品的识别

3．5 光谱数据的预处理

3．6 光谱区间的选择

3．7 模型的评价结果

4 结论与讨论

第五章 总结与展望

1 总结与讨论

2 创新点与解决的问题

3 展望及不足之处

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文