共暴露TiO2纳米材料和镉加剧了ConA诱导的肝炎模型小鼠的肝损伤

摘要

重金属离子镉，在ATSDR20种危险物质中被列为第八大环境污染物。镉污染主要来源于工业废气、废水排放，废渣堆积以及农业上农药和肥料的使用。人类可能通过多种途径暴露镉，比如:吸入含镉的颗粒物，摄入含镉污水和食物，镍镉电池工业和电镀等职业暴露。镉进入血液循环，主要蓄积在人体肝脏、肾脏和骨中，引起器官损伤以及骨质损伤，还可诱发癌症。
　　TiO2纳米材料(TNP)由于具有独特的表面性质，已被广泛应用到各个领域，比如:涂料、颜料、光电池、化妆品以及生物医药领域。在生产、使用和处理过程中纳米材料很有可能被释放到环境（大气、水、土壤等）中去。由于纳米材料较大的比表面积，他们不可避免地吸附环境中的污染物，极大的增加了人群同时暴露他们的几率并造成潜在的健康风险。因而评价两者共同暴露可能引发的毒性效应是纳米材料安全性评价的重要内容。在水生生物中已有的研究表明，纳米材料与环境污染物间的相互作用不仅会影响纳米材料的迁移沉降，环境中的污染物也因为纳米材料的存在改变其原有的生物利用度和毒性。而目前有关纳米材料和重金属共同暴露啮齿类动物的毒性研究很少，并且在啮齿类动物的疾病模型中的研究尚未见报道。
　　研究表明，TNP进入小鼠体内后主要累积在肝脏，由氧化应激引起肝损伤，主要表现为血清中转氨酶的升高，肝内炎症因子释放，肝细胞损伤加重等。镉作为环境中（主要是水中和土壤中）广泛存在的重金属，其急性暴露可诱发肝毒性，镉除了与含巯基的蛋白结合产生活性氧引起氧化应激外，还可以激活枯否使细胞释放促炎细胞因子加剧肝损伤。那么两种物质共同暴露后，对哺乳动物的肝脏会产生怎样的毒性效应？对肝炎小鼠和正常小鼠的肝脏毒性有何差异呢？
　　本研究围绕以上问题，采用静脉注射的方式暴露镉、TNP和两者共同暴露小鼠，考查在生物利用度为100％时，相同剂量的TNP和镉共同暴露比单独TNP或者镉暴露在健康和肝炎小鼠两种模型中引起的毒性效应，并且探索了共暴露引起肝损伤加重可能的毒性机制。
　　本文分三部分对实验内容进行了阐述。
　　第一部分，小鼠尾静脉注射15 mg/kg或20 mg/kg B.W.刀豆蛋白（ConA）后，在不同时间点(3，6，8，12，24 h)，通过检测血清生化、促炎因子以及肝脏病理，系统评价了ConA诱导的肝损伤。结果发现，20 mg/kg B.W.ConA剂量条件下作用6h，小鼠各项指标与肝炎表现有较好的吻合，可作为肝炎模型建立的条件。
　　第二部分，TNP与镉共同暴露对小鼠的毒性效应研究。通过设置溶剂对照组(saline)、镉暴露(1.0 mg/kg B.W.)组、TNP(15 mg/kg B.W.)暴露组以及TNP和镉共同暴露(TNP:15 mg/kg B.W.，镉:1.0 mg/kg B.W.)组，我们首先系统评价了各暴露条件下健康小鼠的肝脏功能。研究发现，健康小鼠在以上三种暴露模式下，脏器系数，肝功指标和炎性因子释放与溶剂对照组都没有显著性差异，材料暴露也没有引起小鼠肝脏的任何病理学改变。因此，共同暴露较低剂量的TNP和镉不会引起显著性的肝损伤。此外，我们还通过设置与健康小鼠暴露相同剂量的正常对照组、肝炎对照组、镉暴露肝炎组、TNP暴露肝炎组以及共同暴露TNP和镉的肝炎组，系统研究了TNP与镉共同暴露对ConA诱导的肝炎小鼠肝损伤的影响。各暴露组材料预暴露48 h后，以20 mg/kg剂量静脉注射ConA，6h后到达肝炎组检测终点。实验结果显示，ConA诱导的肝炎组小鼠比正常对照小鼠脏器系数显著增大，但肝炎组间无差异;肝炎组预共暴露镉和TNP引起较单独暴露镉或TNP更为显著的血清中转氨酶（ALT和AST）水平的升高。因此，镉和TNP共同暴露在ConA诱导的肝炎模型鼠中造成了更严重的肝损伤。对各暴露组小鼠肝脏的病理学检测结果显示，镉和TNP共暴露引起了更为严重的肝脏炎细胞浸润。对上述病理学结果的半定量打分结果也显示，镉与TNP共暴露引起更严重的肝脏病理学的改变。
　　第三部分，我们探究了共暴露镉和TNP在肝炎小鼠模型中引起肝损伤加重的可能机制。通过对检测终点各暴露组小鼠脏器中钛和镉的含量的分析，我们发现，TNP主要累积在肝、脾和肺中，相对于TNP单独暴露，镉和TNP共暴露没有改变TNP在肝炎模型鼠肝脏中的累积;镉主要累积在肝和肾中，共暴露显著增加了肝炎模型鼠肝脏中镉的累积。为进一步明确钛和镉在共暴露情况下的体内累积过程，我们测定了不同暴露时间条件下(2、6、12、24、48、54 h)钛和镉在肝炎模型鼠肝脏中的累积。结果显示，TNP和镉共暴露与TNP单独暴露条件下，肝炎模型鼠肝脏中的Ti含量表现出相似的动态变化过程;而相较于镉单独暴露，共暴露条件下肝炎模型鼠肝脏中的镉含量在各检测时间点都表现出显著性的增大。通过计算浓度-时间曲线下面积，我们发现，共暴露没有改变Ti在肝炎模型鼠肝脏中的积累，而镉的积累在共暴露时增大了30％。因此，共暴露条件下，TNP可能促进了镉离子在肝脏中的积累。随后，我们对三种暴露情况下肝脏的氧化应激水平进行了分析，结果显示，共暴露TNP和镉在肝脏中引起更为显著的GSH水平的降低和MDA水平的升高。对肝脏中炎症因子水平的检测结果显示，共暴露TNP和镉引起了更高水平的TNF-α和IL-1β的释放。此外，我们还发现，TNP和镉共暴露引起更高水平的肝细胞自噬标志蛋白LC3以及凋亡蛋白PARP的表达。
　　综上，共暴露TNP和镉促进镉在肝脏中的累积，但是却没有改变TNP的累积，因此TNP可能提供了镉载体。相比健康小鼠，肝炎小鼠自身具有对炎症的敏感性，镉或者TNP引起了肝内炎症增强，共暴露两者引起了比TNP或者镉暴露更严重的肝损伤。肝损伤加剧可能的机制是:共暴露两者产生了更多的氧化应激，枯否使细胞的激活使其释放更多炎性因子，并且造成了肝细胞的自噬和凋亡加重。这显示了相同剂量的纳米材料或镉暴露于肝炎人群可能会造成比健康人群更加严重的影响，并且纳米材料和镉共同暴露表现出了联合毒性。因此本研究为评价共同暴露对肝炎人群的毒性提供了重要实验依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 引言

1．2 重金属镉离子的暴露及生物毒性

1．2．1 镉的环境暴露风险

1．2．2 镉的毒性机理

1．3 二氧化钛纳米材料

1．3．1 二氧化钛纳米粒子应用和释放到环境

1．3．2 二氧化钛纳米粒子的毒性和相关机制

1．4 ConA诱导的免疫型肝炎

1．5 本课题的研究目的及意义

第二章 肝炎模型的建立

2．1 前言

2．2 实验材料及试剂

2．3 主要实验仪器

2．4 ConA诱导的急性肝炎模型条件摸索

2．4．1 血清中的ALT和AST的含量

2．4．2 肝内TNF-α的释放

2．4．3 模型鼠的肝脏组织病理

2．5 实验结果与讨论

2．5．1 血清中的ALT和AST的含量测定

2．5．2 肝内TNF-α的含量

2．5．3 肝脏组织病理学检测

第三章 二氧化钛纳米材料和镉共暴露小鼠的毒性研究

3．1 前言

3．2 实验材料和试剂

3．3 主要实验仪器

3．4 实验方法

3．4．1 材料表征

3．4．2 注射液的制备

3．4．3 动物分组、暴露以及取材

3．4．4 脏器系数

3．4．5 血清中ALT，AST

3．4．6 肝组织病理学观察

3．4．7 小鼠体内元素分布

3．4．8 肝内炎症因子

3．4．9 肝内氧化应激指标的测定

3．4．10 免疫印迹(Western Blot)

3．4．11 实验数据分析和image J灰度分析

3．5 实验结果与讨论

3．5．1 二氧化钛纳米材料的表征

3．5．2 镉和TNP共暴露对健康小鼠的毒性研究

3．5．3 镉和TNP共暴露对肝炎小鼠的毒性研究

3．5．4 肝炎组小鼠肝损伤加重的机制研究

3．6 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文