大豆诱导型NAC转录因子基因启动子克隆及功能研究

摘要

研究植物对逆境的分子响应机制，利用基因工程提高植物的抗逆性，已成为快速高效得到抗逆作物品种的方法之一。启动子是启动基因表达的开关，在转录水平调控基因的表达模式，胁迫诱导型启动子能避免外源基因非特异性表达对植物生长发育造成的不利影响，其应用成为耐逆植物转基因工程研究的热点之一。
　　本实验室已经证明来源于大豆耐盐品种—圣豆9号的NAC类转录因子基因GmST1和GmST2为非生物胁迫响应基因，其表达受盐、旱等多种非生物胁迫诱导。在此基础上，本文克隆了这两个基因的启动子区域并进行启动子启动转录的活性分析，确定了这两个启动子的非生物胁迫诱导特性及组织特异性表达模式，同时通过启动子分段活性分析确定了对其诱导特性起重要作用的关键片段，并初步探讨了其中关键顺式作用元件的作用，为诱导型启动子及关键顺式元件在耐逆植物基因工程中的应用奠定了基础。
　　本论文的主要实验结果如下:
　　1圣豆9号NAC类转录因子基因GmST1启动子功能研究
　　1.1 GmST1启动子序列及顺式作用元件分析
　　通过同源克隆的方法从大豆耐盐品种—圣豆9号中克隆出了GmST1启动子，其序列包括翻译起始密码子ATG上游2133 bp的核苷酸序列。利用PLACE和PlantCARE在线分析系统对GmST1基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行分析，发现该启动子中包含TATA box、GT1 GM SCAM4、ABRE、W-box、LTR结合元件等顺式作用元件。
　　1.2 GmST1全长启动子的表达模式分析
　　构建了GmST1全长启动子驱动GUS报告基因的植物双元表达载体，转化拟南芥，获得了T3代转基因纯系种子。
　　对全长启动子转基因拟南芥进行了GUS染色分析，发现:(1)转基因拟南芥子叶叶脉、初生真叶基部、主根根尖、侧根原基、花药及成熟花萼维管组织中均有表达;(2) NaCl处理条件下，GUS基因在根维管组织和叶片中受到显著诱导上调，且施加外源ABA同样诱导GUS表达上调。确定了该启动子盐和ABA诱导特性及表达范围。
　　1.3 GmST1启动子盐诱导关键片段的确定
　　构建了GmST1启动子不同5'缺失片段驱动GUS报告基因的植物双元表达载体，转化拟南芥，获得了片段P1和P2的T3代转基因纯系种子。
　　GUS染色结果显示，P1和P2同启动子全长一样具有启动转录活性，但GUS的表达模式发生了变化，P1∷GUS和P2∷GUS在根尖中的表达强度和范围小于全长启动子，且NaCl胁迫下根中GUS染色无显著增强。
　　构建了GmST1启动子不同5'缺失片段驱动LUC报告基因的植物瞬时表达载体，利用拟南芥瞬时表达体系分析片段的启动转录活性。
　　LUC报告基因活性分析表明4个缺失片段均有较强启动转录活性，但在盐胁迫下GmST1全长启动子启动的LUC活性显著性上调4倍左右，P4∷LUC中活性显著性上调2倍左右，其他片段上调不明显。
　　以上结果说明GmST1启动子全长和P1之间长为733 bp(-2133 bp～-1400 bp)的片段为启动子在根中响应盐胁迫的关键片段，片段P4（-300 bp～-1 bp）对盐胁迫响应也起部分作用。
　　2圣豆9号NAC类转录因子基因GmST2启动子功能研究
　　2.1 GmST2启动子序列及顺式作用元件分析
　　通过同源克隆的方法从大豆耐盐品种—圣豆9号中克隆出了GmST2启动子，其序列包括翻译起始密码子ATG上游2024 bp的核苷酸序列。利用PLACE和PlantCARE在线分析系统对GmST2基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行分析，发现该启动子中包含TATA box、MBS、MYS、W-box、DREB结合元件等顺式作用元件。
　　2.2 GmST2启动子全长的表达模式分析
　　构建了GmST2启动子全长驱动GUS报告基因的植物双元表达载体，转化拟南芥，获得了T3代转基因纯系种子。
　　对全长启动子转基因拟南芥进行了GUS染色分析，发现:(1)转基因拟南芥子叶叶脉、初生真叶、主根根尖、萼片、花瓣、花丝、雌蕊柱头以及角果的果皮和果柄中均有表达;(2) ABA处理24 h条件下，GUS基因在子叶中受到显著诱导上调。确定了该启动子ABA诱导特性及表达部位。
　　2.3 GmST2启动子ABA诱导关键片段的确定
　　构建了GmST2启动子不同5'缺失片段驱动GUS报告基因的植物双元表达载体，转化拟南芥，获得了片段P2-P7的T3代转基因纯系种子。
　　GUS染色结果显示，P2同启动子全长一样具有启动转录活性，P3-P5活性显著降低，P7活性部分恢复，说明P2和P3之间的片段为转录增强的关键片段，且P7和P5之间（-1053 bp～-350 bp）存在转录活性抑制元件。ABA处理下，P7显示出诱导活性，且诱导部位主要在子叶和真叶，其他片段未显示诱导活性。以上结果说明P7（-350bp～-1 bp）均对启动子在叶中响应ABA起作用。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 大豆耐盐性研究

1．1 盐胁迫对大豆的影响

1．2 大豆耐盐机制

2 NAC转录因子家族

2．1 NAC的结构域及其分类

2．2 NAC家族转录因子在植物生长发育中的作用

2．3 NAC家族转录因子在生物胁迫和非生物胁迫中的作用

2．4 NAC的调控

3 植物启动子研究

3．1 染色体的结构以及在转录中的作用

3．2 启动子的分类

4 启动子的分析方法

4．1 启动子的获得

4．2 启动子的生物信息学分析

4．3 启动子的功能分析

第二章 大豆GmST1基因盐诱导启动子研究及关键片段分析

2 大豆GmST1基因盐诱导启动子研究及关键片段分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果分析

2．4 讨论

第三章 大豆GmST2基因诱导型启动子的研究分析

3 大豆GmST2基因诱导型启动子的研究分析

3．1 材料与方法

3．2 结果与分析

3．3 讨论

参考文献

附表 论文所用引物

致谢