钴铬合金颗粒及其金属离子Co2+，Cr3+导致的关节假体松动的基础研究

摘要

随着老龄化人群的增长，骨性关节炎的发病逐年增高，而目前治疗末期骨关节炎的有效手段仍是人工全关节置换术，尽管人工关节的材质及设计一直不断在改进，但是假体无菌松动仍就是人工关节假体置换术后最常见的远期并发症，而且发生率居高不下。目前治疗假体无菌性松动仍以假体翻修为主，但仍未从根本上解决假体松动的问题。
　　随着科技的进步，人工假体的材料与设计也在不断更新，其植入人体后，随着日常生活的应用，磨损颗粒也随之产生，这些颗粒主要包括钛合金（Ti-6Al-4V）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)和钴铬合金(Co-Cr)，而且目前大量实验研究也已经表明磨损颗粒在无菌性假体松动的发生中起着关键作用，磨损颗粒被假体周围细胞吞噬，这些细胞包括骨髓间充质干细胞、巨噬细胞、成骨细胞、淋巴细胞、成纤维细胞，随之引起细胞因子释放，它们会导致机体发生不同的炎症及机体免疫反应，然后导致成骨细胞功能下调，破骨细胞功能活化，最终导致骨溶解和无菌性松动。目前Co-Cr合金因其耐磨性、耐腐蚀性及耐高温性而广泛应用于假体制造，故而本课题将钴铬合金（Co-Cr）纳入实验研究。而且一旦假体植入体内，由于体液的作用，假体周围将出现各种离子形式，对于Co-Cr合金来说，其离子形式大多以Co2+，Cr3+形式存在。所以我们将Co-Cr颗粒及其离子形式一并研究，观察它们的异同。
　　由于骨量是骨丢失和骨形成之间的动态平衡来维持的，来源于单核巨噬细胞系的破骨细胞具有促进骨吸收减少骨量的作用，而来自骨髓间质干细胞的成骨细胞增加骨沉积而增加骨量。某些炎症性细胞因子导致破骨细胞活化而促使骨溶解。调节破骨细胞形成的两种重要因子分别是细胞核因子-κB受体活化因子(RANK)和细胞核因子-κB受体活化因子培基(RANKL)。RANK是RANKL的生物信号膜受体，属于TNF受体超家族成员，在破骨细胞前体细胞、成熟破骨细胞和软骨细胞中表达，RANK同时出现在单核细胞和组织巨噬细胞，RANKL-RANK链可以启动破骨细胞形成和成熟破骨细胞功能的活化。目前OPG/RANKL也公认是调节破骨细胞分化成熟的重要条件。
　　为了研究磨损颗粒及其相对应离子形式的骨溶解机理，探明成骨细胞及破骨细胞分化、功能活化的分子学基础。人们建立了实验模型，目前用于研究的实验模型包括体外细胞实验模型、假体植入动物模型等，但是体外实验模型得出的结论只能简介用来说明体内的过程，动物模型中常用兔、狗、羊及马等大型动物但是缺点是不易于饲养管理，研究费用高，样本含量受到限制，尤其不适合新型治疗策略的研究，进而限制了这些动物模型的广泛使用。小鼠与人类具有基因同源性，利于进行生物学研究等优点，成为研究假体松动模型的新的选择。Dr.Wooley实验室首创小鼠的气囊模型用来研究不同颗粒的细胞反应和骨溶解效果，但是其缺点不能作为长期的体内研究。为了更接近体内假体磨损颗粒环境，需要设计一理想的模型。我们设计该实验将建立模型并应用动物模型研究假体周围松动骨溶解的分子生物学机制。
　　在本次研究中，我们在体外研究首先探讨Co-Cr合金及其对应的离子形式在不同浓度下对成骨前体细胞的生长、分化成熟、参与炎性反应及破骨细胞调控等所产生的不同影响，最后构建小鼠膝关节假体置换后无菌性松动的模型，通过该模型来进一步验证颗粒及其离子形式刺激的成骨细胞前体细胞对破骨细胞分化成熟的重要调控作用。成骨前体细胞MC3T3-E1（CRL-2594）购买于American type culture collection(ATCC)公司，置于α-DMEM培养液中培养，其中培养液中含5％胎牛血清的，2 mM左旋谷酰胺，1mM丙酮酸钠，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素，37℃，5％ CO2温箱培养。培养出一定数量后，加入10mM磷酸甘油，50μg/ml抗坏血酸和100 nM地塞米松诱导成骨前体细胞向成骨细胞分化，通过碱性磷酸酶(ALP)染色来确定成骨细胞的有效分化。将诱导后的细胞分别与多种浓度的钴铬合金颗粒（0.15，0.3，0.625，1.25，2.5和5mg/mL）及其离子形式Co2+、Cr”(62，125，250，500，1000μ M)共同培养。并收集上清液，在颗粒及其离子形式刺激后72小时通过MTT来检测细胞的增值反应。同时分别测定细胞内及培养液中乳酸脱氢酶LDH的活性来反应不同浓度的钴铬合金颗粒及其离子的细胞毒性。再测定裂解的细胞液中ALP蛋白浓度，并进行细胞的免疫化学ALP染色以便检测向成骨细胞分化的程度。RT-PCR测定细胞MCP-1，TNF-α，IL-6，RANKL，OPG，Runx2, LRP-5，0sx和NFATc1的基因表达。在体内的实验部分，通过钛钉植入胫骨近端，模仿膝关节置换术和假体周围内注射钴铬合金颗粒构建小鼠无菌性假体松动的模型，在术后将其分为四组:(1)颗粒实验组:在胫骨近端假体周围注射10μl钴铬合金颗粒悬浮液(4×104)，一周后向关节腔内注射50μl含有5×105 MC3T3-E1的培养液，这些细胞是与钴铬合金颗粒(2.5mg/ml)共培养的(n=12);(2)离子实验组:在胫骨近端假体周围注射10μl钴铬合金颗粒悬浮液(4×104)，一周后向关节腔内注射50μl含有5×105 MC3T3-E1的培养液，这些细胞是与Co2+(500μM)共培养的(n=12);(3)假体松动对照组:在胫骨近端假体周围注射10μl钴铬合金颗粒悬浮液(4×104)，一周后向关节腔内注射50μl含有5×105未受颗粒及离子刺激的MC3T3 E1细胞的培养液(n=6);(4)无假体松动的稳定组:仅仅只做钛钉植入手术，不注射钴铬合金颗粒和MC3T3-E1细胞。钛钉植入完毕后立即使用MicroCT进行假体周围骨密度测定，到5周后，处死老鼠之前一天，再次行假体周围骨密度测定。术后5周将所有老鼠处死，并离断患侧膝关节，将小腿进行拔钉实验，通过拔钉的力量大小来验证假体松动的程度。拔钉后的组织立即投入固定液中固定，固定完毕后做石蜡病理切片，首先进行假体与骨界面之间膜的厚度测定，以此反应炎症反应的轻重。然后将组织切片进行TRAP染色，以便观察确定假体周围组织中破骨细胞数量及分化成熟怙况。其他组织切片进行免疫组织化学染色TNF-α，RANKL和Runx2。
　　体外实验中，在细胞增殖及分化的过程中，单纯成骨诱导液及添加了Cr(Ⅲ)的两组细胞表现出成骨细胞的多边形，而添加了Co(Ⅱ)组细胞表现出伸出更多的触角，细胞局部表现出透亮区，Co-Cr颗粒组细胞表现出长梭形，吞噬的颗粒集中于细胞中央。MTT细胞增殖实验钴铬合金颗粒及其离子形式均不同程度抑制细胞的增殖。钴铬合金颗粒浓度大于2.5mg/mL及其离子1，000μ M表现明显的毒性作用。对于ALP蛋白及染色检测，所有实验组除Cr(Ⅲ)均表现出不同程度的抑制，浓度越高抑制越明显。对于PCR，钴铬合金颗粒组显著促进MCP-1、TNF-α、IL-6基因表达，然而Co(Ⅱ)组RANKL和NFATc1基因明显表达升高，而OPG和0sx基因则被抑制表达。体内实验中，成功构建了小鼠膝关节假体无菌性松动模型，颗粒组(Co-Cr)和离子组(Co(Ⅱ))拔钉力量均小于假体松动对照组和无假体松动的稳定组，而假体周围形成的膜均厚于这两对照组，两个实验组的TRAP+的细胞数量均高于无假体松动的稳定组，而假体周围骨组织密度测定中，两实验组均明显小于另两对照组。
　　总之，MC3T3-E1细胞即成骨前体细胞对Co-Cr磨损颗粒及其离子形式在各个方面均表现出不完全相同的生物学特性，包括细胞形态、增殖、毒性、成骨及炎症反应等。在本次实验研究中，Co-Cr磨损颗粒及其离子形式，均对成骨前体细胞的成骨分化表现出不同程度的抑制作用，且Co-Cr磨损颗粒及Co(Ⅱ)离子刺激的成骨前体细胞都会促进多种炎性因子及相关因子的基因表达，从而进一步参与假体周围炎性反应和骨溶解最终导致假体松动。更重要的是，Co(Ⅱ)离子刺激的成骨前体细胞高表达RANKL基因及抑制OPG基因表达，从而大大增加RANKL/OPG比值，而这一比值正是目前公认的调节破骨细胞分化及成熟的重要因子。体内实验室对假体周围的TRAP+细胞的计数也证实了这一点。在其他方面，Co-Cr磨损颗粒可以明显促进成骨前体细胞炎症相关的基因表达像MCP-1、TNF-α及IL-6，来共同参与假体周围的炎症反应，以至于最后造成假体松动。所以本实验研究最重要的结论:不但是Co-Cr颗粒，而且离子Co(Ⅱ)也可以通过刺激成骨前体细胞来调控破骨细胞的分化成熟，并参与假体周围炎症反应，最终导致假体无菌性松动。

目录

声明

摘要

符号说明

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表

英语论文一

英语论文二