TSLP在角膜上皮细胞烟曲霉菌感染中对Th2型获得性免疫的作用研究

摘要

背景:真菌性角膜炎(fungal keratitis，FK)是发展中国家常见的致盲性眼病，如不能及时诊断和治疗将导致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除。目前认为，机体的免疫功能与真菌感染和病情进展密切相关。因此深入研究角膜免疫防御体系，对寻找角膜抗真菌感染的有效途径有着重大的理论价值。
　　角膜上皮细胞是角膜抵抗真菌的第一道天然免疫屏障，通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)发挥抗真菌的作用，PAMPs包括Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)，NOD样受体(NOD likereceptors，NLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)。TLRs，NLRs和CLRs相互作用，三者协同增强核转录因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)的激活，诱导炎性介质和抗菌肽分泌，如白介素(interleukin，IL)-1β，IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)-α，人β防御素(humanbetadefensin,hBD)-2和LL37。
　　激活的固有免疫能够启动有效的获得性免疫。近年研究发现，与首次真菌感染的小鼠相比，二次白色念珠菌感染的小鼠角膜炎症减轻，愈合加快;血清中的免疫球蛋白水平增高，同时角膜中免疫球蛋白沉积和淋巴细胞浸润增多。这提示角膜真菌感染中，除了天然免疫，还启动了获得性免疫，两者之间的相互作用在眼部的急性和慢性炎症反应中发挥重要作用。
　　胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是获得性免疫反应中发挥重要作用的组分，刺激树突状细胞活化成熟，促进B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖和分化，启动获得性免疫的作用。迄今关于TSLP的研究多限于过敏性疾病，如哮喘、特应性皮炎，过敏性结膜炎等。目前在感染性疾病，特别是真菌感染中有关TSLP的研究甚少。Hideaki Kouzaki等发现，链格孢菌刺激人呼吸道上皮细胞能上调TSLP表达，但是TSLP是否参与角膜真菌感染，是否参与以及如何参与角膜真菌感染的获得性免疫仍不清楚。
　　目的:研究烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞对胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）表达的影响，探讨外源性TSLP对Th2细胞分化的作用。研究烟曲霉菌感染角膜上皮细胞后TSLP表达对淋巴细胞增殖、活化及分化的影响，阐明TSLP在角膜真菌感染获得性免疫中的作用。
　　方法:1.制备烟曲霉菌菌丝，使用购自中国典藏培养物保藏中心的烟曲霉菌菌株CCTCC93024。菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养24h后56℃加热60min灭活，研磨成20-40μ m的片段于-80℃保存。
　　2.培养人永生化角膜上皮细胞(Telomerase-immortalized humancorneal epithelial cells)，将培养的细胞随机分为两组:烟曲霉菌刺激组和空白对照组。实验组更换AF菌丝（106个/ml）刺激液，对照组更换F12/DMEM培养液。于不同时间点(1h，3h，6h，12h，24h，48h)收集细胞上清液，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TSLP的表达;
　　3.密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，接种于六孔板上（1×106个/孔），随机分为实验组和空白对照组。实验组以重组人TSLP(1ng/ml)刺激，3d后收集两组的细胞及上清液。流式细胞术检测两组细胞中CD4+T细胞IL-4、IL-13的阳性率，ELISA检测细胞上清液中IL-4,IL-13的分泌，并进行统计学分析;
　　4.利用transwell体系共培养PBMCs与THCEs。根据基因组数据库设计人TSLP的siRNA序列，采用siRNA干扰的方法抑制THCEs中TSLP表达。按照THCE处理方式的不同，设立对照组，烟曲霉菌刺激组，TSLP-siRNA+烟曲霉菌刺激组，阴性siRNA+烟曲霉菌刺激组。在siRNA转染24h后，分别更换F12/DMEM培养液，AF菌丝刺激液。于不同时间点收集上层的PBMCs(1d，2d，3d，5d，7d)及上清液(1d，3d，5d，7d);
　　5.CFSE染色检测PBMCs的增殖情况;流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞早期活化标志CD69的表达;RT-PCR检测PBMCs中IL-4、IL-13mRNA表达，胞内细胞因子染色检测CD4+T细胞IL-4/IL-13的阳性率;ELISA检测PBMCs上清中IgG、IgA水平。
　　结果:烟曲霉菌刺激3h后，THCEs中TSLP的蛋白表达水平显著高于对照组;外源性TSLP刺激PBMCs， Th2型细胞因子(IL-4,IL-13)的分泌增多，CD4+T细胞IL-4、IL-13的阳性率显著提高。TSLP siRNA转染人角膜上皮细胞后，TSLPmRNA及蛋白水平表达均受到显著抑制。与对照组相比，烟曲霉菌刺激组的PBMCs中淋巴细胞增殖明显;CD4+、CD8+T细胞和CD19+B细胞表面CD69表达显著升高，并于第2天达到最高水平;PBMCs中IL-4,IL-13mRNA表达增加，CD4+T细胞的IL-4,IL-13阳性率显著提高;收集的PBMCs上清中IgG、IgA水平升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。TSLP siRNA敲减THCEs表达TSLP，淋巴细胞的增殖、活化及Th2分化均受到抑制。此外，角膜上皮细胞分泌的TSLP促进B细胞产生IgG，而对IgA水平无明显影响。
　　结论:烟曲霉菌菌丝刺激THCEs后，TSLP表达显著上调，外源性的TSLP能促进PBMCs中的CD4+T细胞向Th2方向分化。THCEs感染烟曲霉菌后产生的TSLP能促进T、B淋巴细胞增殖、活化，从而启动获得性免疫，并且能够诱导CD4+T细胞向Th2方向分化。此外，THCEs来源的TSLP增强B细胞介导的体液免疫。因此，TSLP是角膜抗真菌获得性免疫中的关键因素，表明TSLP可能是真菌性角膜炎治疗中的潜在靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一、主要实验试剂与器材

二、方法

结果

(一)烟曲霉菌对THCEs中TSLP表达的影响

(二)TSLP对PBMCs向Th2方向分化的影响

(三)TSLP siRNA敲减THCEs中TSLP表达的有效性检测

(四)烟曲霉菌刺激THCEs对共培养体系中淋巴细胞增殖的影响

(五)烟曲霉菌刺激THCEs对共培养体系中淋巴细胞活化的影响

(六)烟曲霉菌刺激THCEs对共培养体系中CD4+T细胞向Th2方向分化的影响

(七)烟曲毒菌刺激THCEs对共培养体系中B细胞功能的影响

讨论

结论

附图

参考文献

综述 真菌TLR配体增强TSLP表达及其在适应性免疫中的作用

致谢

攻读学位期间发表论文及获奖情况