同源重组功能缺陷对H2AX磷酸化型微核发生的影响

摘要

DNA损伤种类多，发生频率高，是细胞生存、分裂和执行正常功能的主要威胁之一。DNA损伤既可以由内源性的活性氧和DNA复制错误等导致，也可由各种环境因素产生。有机体在漫长的进化过程中，获得了多种不同类型的修复方式，用于多样的DNA损伤。其中，作为最严重的损伤形式之一，DNA双链断裂可由同源重组(Homologous recombination repair，HRR)和非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)两条通路修复。同源重组(HRR)又被称为基本重组(general recombination)，是指在同源序列之间发生的重组，它不需要特意的DNA序列，而是在两个DNA分子的同源序列间进行单链或双链片段的互换。在同源重组过程中的不同阶段，每一步又需要不同的蛋白参与，比如早期的BRCA1和CtIP，中期的RPA1和RAD51，后期的TOP1、MUS81等。
　　微核是指独立于细胞浆中，游离于细胞主核之外的体积微小的核。目前研究普遍认为微核的形成原因主要是因为染色体由于损伤而发生断裂，或者因纺锤丝出现故障而无法有效牵引染色体，导致在有丝分裂后期，细胞进入下一次有丝分裂时，染色体片段或整条染色体不能随有丝分裂进入子细胞，从而使它们从细胞主核中脱离而形成微核。微核常被用于说明遗传物质损伤的程度，是衡量基因组不稳定性和遗传毒理学的重要指标之一。Terradas等研究者及本实验室的前期研究中均发现了一种新型微核，此类微核因呈现出均匀弥散的H2AX磷酸化，因而将其称之为MN-γ-H2AX(+)。该类微核在总微核中的比例大约为1/5到1/3。我们实验室早期发现，当使用导致ROS（活性氧）上调的H2O2处理细胞后，可检测到微核尤其是MN-γ-H2AX(+)频率的显著上调，而抗氧化剂NAC的加入又能够在一定程度上拯救由于H2O2加入所导致的微核频率的增加，即ROS能够诱导MN-γ-H2AX(+)的发生。而当使用羟基脲(hydroxyurea，HU)，阿非迪霉素(aphidicolin，APH)等造成复制压力的药物处理细胞24小时后，MN-γ-H2AX(+)频率可升高2到3倍，而其他类型微核频率升高幅度相对较低;干扰DNA复制蛋白RPA1后，MN-γ-H2AX(+)频率也呈现显著增加，即这类微核能够被复制压力特异性诱导。此外，通过分析MN-γ-H2AX(+)形成与遭遇复制压力细胞的时间关联，发现MN-γ-H2AX(+)主要在S期产生。又因为上述药物处理主要导致DNA复制叉的塌垮（collapsed replication forks），而复制叉的塌垮主要由同源重组进行修复，那么是否同源重组功能缺陷不能有效修复塌垮复制叉从而导致MN-γ-H2AX(+)的增加？MN-γ-H2AX(+)是否能反应同源重组修复的能力呢？
　　基于以上问题，我们通过干扰同源重组不同阶段成员的功能使同源重组通路产生缺陷，继而发现同源重组功能缺陷可有效诱导微核频率的增加;但不同阶段成员的功能缺陷所造成的同源重组功能障碍诱导微核发生的效能并不相同，尤其反映在MN-γ-H2AX(+)的发生频率;此外，我们还发现同源重组功能缺陷导致微核频率的变化与ROS及细胞周期的改变均有一定的联系。
　　目的：
　　本研究旨在进一步明确MN-γ-H2AX(+)的发生机制;研究同源重组通路在降低微核发生并维持基因组稳定性中的作用;评估MN-γ-H2AX(+)作为同源重组功能指标的可行性。
　　方法：
　　以U2OS细胞系为研究材料，干扰同源重组各阶段的不同成员CtIP（早期阶段）;RAD51（中期阶段）和TOP1、MUS81（后期阶段）的功能。探讨MN-γ-H2AX(+)发生频率与同源重组功能之间的关系。
　　1.通过siRNA干扰同源重组通路及非同源末端连接通路中不同成员的表达，利用Western blotting和Real-time PCR技术检测干扰效率。
　　2.利用免疫荧光技术检测主核和微核中DNA双链断裂损伤标记γ-H2AX的染色情况。
　　3.利用流式细胞术检测干扰不同基因后ROS水平的变化。
　　4.利用流式细胞术检测干扰同源重组通路中不同基因后细胞周期的变化。
　　结果：
　　1.复制叉停滞对微核的发生没有影响，而复制叉塌垮则会诱导微核尤其是MN-γ-H2AX(+)频率的显著增加。
　　2.同源重组上游阶段CtIP功能缺陷不能特异性诱导MN-γ-H2AX(+)的发生。
　　3.同源重组中游阶段RAD51功能缺陷可特异性诱导MN-vH2AX(+)发生。
　　4.同源重组下游阶段TOP1、MUS81功能缺陷可特异性诱导MN-γ-H2AX(+)发生。
　　5.非同源末端连接过程中关键成员LIG4的功能缺陷对MN-γ-H2AX(+)的发生影响较小。
　　6.同源重组功能缺陷诱导MN-γ-H2AX(+)增加部分是通过ROS介导。
　　7.同源重组功能缺陷诱导MN-γ-H2AX(+)增加与细胞周期的变化有一定关联。
　　结论：
　　同源重组修复通路中不同成员的功能缺陷诱导微核发生的效能并不相同，中下游阶段成员功能缺陷可有效诱导MN-γ-H2AX(+)频率的增加。同源重组功能缺陷诱导微核发生的机制与ROS以及细胞周期的变化有关。非同源末端连接通路中LIG4功能缺陷不能特异性诱导MN-γ-H2AX(+)的发生。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

一、复制叉停滞和复制叉塌垮对微核发生的影响

二、同源重组通路中不同阶段成员的功能缺陷诱发微核的效能

三、DNA双链断裂水平对微核发生的影响

四、同源重组通路中不同成员的功能缺陷对ROS的影响及其对MN-γ-H2AX(+)发生的贡献

五、同源重组不同阶段成员的功能缺陷引起细胞周期的改变与MN-γ-H2AX(+)发生的关联

讨论

结论

参考文献

致谢

硕士期间待发表论文及参与发表的论文