免疫性血小板减少症患者外周血中负性协同刺激分子PD-1及其配体的表达

摘要

研究背景与目的：
　　免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia，ITP)是由机体免疫功能紊乱引起的以血小板破坏增加致数目减少为特征的自身免疫性出血性疾病，主要以自身血小板抗体介导的血小板破坏增多为特征。近年的研究表明，ITP作为一种异质性自身免疫性疾病，其发病机制不仅包括体液免疫功能的紊乱，还包括细胞免疫功能的失调，其中T淋巴细胞起重要作用。T细胞的激活除需要组织相容性抗原(MHC，Major histocompatibility antigens)-抗原肽复合物刺激（即第一信号）外，还需要共刺激信号（又称第二信号）。若缺乏后者，则导致T细胞无能，甚至发生程序性凋亡。程序性死亡因子1(PD-1，programmed death-1)及其配体PD-L1(programmed death ligand-1)是近年研究发现的重要的负性协同刺激分子，介导负性协同刺激信号，被认为与移植排斥反应、自身免疫性疾病、慢病毒感染、肿瘤免疫逃逸等疾病密切相关。
　　PD-1是一个免疫抑制性受体，其结构和功能类似于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CILA-4，cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4)，可为T细胞活化提供抑制性信号。PD-1可通过抑制自身反应性初始T细胞向T效应细胞(Teff, effectorT cells)转化;诱导Teff向调节性T细胞(Treg，regulatory T cells)转化;以及通过激活Treg或树突状细胞(DCs，dendritic cells)抑制Teff等机制抑制T细胞免疫，在建立与/或维持外周自身免疫耐受中起到十分重要的作用。
　　PD-L1（又称B7-H1）和PD-L2(又称B7-DC)是PD-1的两种配体。PD-1与其配体PD-L1/PD-L2的结合，可明显抑制T细胞受体(TCR，T cell receptor)介导的T细胞的增殖和细胞因子的产生，使细胞停留在G0/G1期。PD-1/PD-L信号通路是在CTLA-4/B7被发现之后的又一个重要的负向调节T细胞活化的刺激通路，其功能主要是削弱、限制T细胞、B细胞和骨髓细胞的活化以及外周炎症反应。研究已经证明，PD-1信号传导通路的异常可导致外周免疫耐受的打破和自身免疫性疾病的发生，而ITP作为一种组织特异性自身免疫性疾病，其发病是否与PD-1/PD-L通路相关目前国内外尚无报道。本研究拟通过检测ITP患者外周血T淋巴细胞和树突状细胞(DCs)上PD-1与PD-L1及PD-L2的表达及血浆中可溶性PD-1(sPD-1)的水平，PBMCs中sPD-1转录因子表达量，探讨PD-1/PD-L通路在ITP发病中的意义及可能的机制。
　　研究对象与方法：
　　外周血46份标本均来自于2014年11月至2015年4月住院患者的新发或复发的活动性ITP患者，所有患者都符合ITP的诊断标准，采样前至少一周未接受过免疫抑制剂治疗。前30份标本，其中女22例，男8例，年龄14-76岁，中位年龄为39.1岁，血小板计数(0-27)×109/L，中位血小板计数为8.7×109/L。这30份标本用于流式细胞术(FCM，Flow Cytometry)的检测及酶联免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)实验。另外16份标本，其中女10例，男6例，年龄16-72岁，中位年龄为39.5岁，血小板计数(2-19)×109/L，中位血小板计数为10×109/L。这16份标本用于逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)的检测。正常对照来自于36名健康志愿者，女20例，男16例，年龄19-72岁，中位年龄38岁，血小板计数(129-241)×109/L，中位184×109/L。采用FCM检测外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞和DCs上PD-1与PD-L1及PD-L2的表达，采用酶联免疫吸附实验检测血浆中可溶性PD-1(sPD-1)的水平，采用逆转录PCR(reversetranscription PCR，RT-PCR)检测外周血单个核细胞表面sPD-1转录因子的表达量。
　　研究结果：
　　1、T淋巴细胞表面PD-1的表达
　　CD4+T淋巴细胞表面PD-1的阳性率明显高于健康对照组(P＜0.01);CD8+T淋巴细胞表面PD-1的阳性率也明显高于健康对照组(P＜0.01)。
　　2、DCs表面PDL1和PDL2的表达
　　PDL1在ITP患者树突状细胞上的平均荧光强度明显低于健康对照组(P＜0.05);PDL2在ITP患者树突状细胞上的平均荧光强度明显低于健康对照组(P＜0.01)。
　　3、血浆sPD-1浓度
　　ITP组中血浆sPD-1浓度明显高于健康对照组(P＜0.01)。
　　4、外周血单个核细胞表面sPD-1转录因子表达量
　　ITP组中外周血单个核细胞表面sPD-1转录因子表达量明显高于健康对照组(P＜0.01)。
　　研究结论：
　　结果显示，异常表达的PD-1、PD-L1、PD-L2可能在ITP的发病过程中起到核心作用。树突状细胞表面低表达的PD-L1、PD-L2，外周血单个核细胞表面sPD-1转录因子表达量升高，血浆中高表达的sPD-1可能参与T淋巴细胞与抗原递呈细胞之间的信号传导通路，从而导致T淋巴细胞的自身活化而引起ITP的发病。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第二章 材料与方法

(一)研究对象

(二)实验材料

(三)实验方法

第三章 实验结果

1、T淋巴细胞表面PD-1的表达

2、DCs表面PDL1和PDL2的表达

3．血浆sPD-1浓度

4、外周血单个核细胞sPD-1的mRNA表达量

第四章 讨论

第五章 结论

附表与附图

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文