Zdhhc15b及bupropion在神经系统发育过程中的作用及其机制的研究

摘要

对于大多数蛋白质来说，多肽链翻译后还要进行多种加工修饰才具备生物学活性。蛋白质翻译后修饰的主要方式有:磷酸化、糖基化、脂质化等等。棕榈酰化作为脂质化修饰方式的一种，其功能是由DHHC蛋白质执行的。DHHC蛋白最早是在酿酒酵母中发现的，正向遗传筛选结果表明Erf2/Erf4和Akr1是酵母中的DHHC蛋白，都富含特征性锌指样(Zinc finger)-DHHC(Aspartate-histidine-histidine-cysteine)结构域，负责RAS2和酵母酪蛋白激酶2的修饰。除了在酵母已确定的7种DHHC蛋白，哺乳动物已发现23种DHHC家族成员，这些DHHC蛋白又被细分为不同的亚家族。
　　此外，随着生活节奏的加快，抑郁症的发病率逐年上升。虽然人类在抑郁症的研究方面付出了大量的努力，但对其发病机制仍知之甚少。同时，抗抑郁药发挥其治疗作用的分子和细胞机制尚未给出很好的解释。早期关于抑郁症的病理生理学假说是基于主要的神经递质5-羟色氨(5-hydroxy tryptamine，5-HT)和去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)的释放减少。因此，5-羟色氨和去甲肾上腺素成为目前抑郁症治疗的措施和药物开发的主要目标。但随着神经生物学的发展，简单的神经递质学说无法解释抑郁症的发病机制。最近，神经元的神经生成作用的降低为抑郁症提供了崭新的生物学和细胞学研究基础。有研究表明抗抑郁药可能会促进神经元再生增加细胞数目从而达到治疗抑郁症的目的，但具体的作用机制还尚未明确。
　　本实验用斑马鱼作为模式动物，同时探讨了DHHC家族成员Zdhhc15b以及抗抑郁药物bupropion在斑马鱼神经系统发育中的作用及机制。
　　第一章 Zdhhc15b基因调节斑马鱼胚胎间脑多巴胺能神经元分化的研究
　　目的：
　　DHHC15(zinc finger DHHC-type containing15)是哺乳动物23种DHHC蛋白中的第15号成员。该基因是由332个氨基酸组成的跨膜蛋白，具有四个跨膜结构域和一个DHHC(Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD(Cysteine richdomain)特征结构域。与其他成员相比，目前对DHHC15的研究报道还比较少，且停留于体外水平。据报道，DHHC15与X连锁精神发育迟滞相关，且DHHC15可以修饰相应的神经蛋白，这提示DHHC15在神经系统发育中起到重要作用。但是，DHHC15在神经系统发育过程中的功能和机制尚不明确。分析斑马鱼DHHC基因发现Zdhhc15b与哺乳动物DHHC15同源且两者编码的氨基酸序列高度保守。因此，本研究利用斑马鱼作为模式动物，通过注射morpholino建立人类DHHC15的同源基因Zdhhc15b的下调模型，利用斑马鱼胚胎整封原位杂交(Whole-mount in situ hybridization，WISH)、整封免疫荧光、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、免疫组化、行为学检测等方法研究Zdhhc15b对斑马鱼神经系统发育的影响，并深入探讨了其在斑马鱼间脑多巴胺能神经元（dopaminergic neurons，DA neuron）分化中的作用及其机制。
　　方法：
　　首先，为了了解Zdhhc15b在斑马鱼早期胚胎发育中的表达模式，本课题设计了Zdhhc15b的特异性引物及地高辛标记的反义RNA探针，利用RT-PCR和原位杂交(whole-mount in situ hybridization，WISH)技术检测Zdhhc15b在斑马鱼胚胎发育各时期的表达以及分布情况。原位杂交结果显示，Zdhhc15b是母源性表达，并且从18hpf到48hpf, Zdhhc15b大量存在于脑区，尤其是间脑。RT-PCR实验结果显示Zdhhc15b的表达从75％外包期开始增加，18hpf到72hpf逐渐达到峰值。提示Zdhhc15b可能在斑马鱼间脑发育中的特定阶段发挥重要作用。
　　多巴胺能神经元（dopaminergic neuron，DA neuron），作为脊椎动物间脑的重要组成部分，在认知、运动控制和内分泌调节中起关键作用。Zdhhc15b下调表达引起的间脑发育缺陷和学习认知障碍促使本课题进一步研究Zdhhc15b在多巴胺能神经元发育中的潜在作用。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)是多巴胺能神经元的特异性标记物。
　　结果：
　　Zdhhc15b下调前后多巴胺能神经元前体细胞的增殖周期与对照相比无明显变化。因此推断，Zdhhc15b对多巴胺能神经元前体细胞的增殖没有影响;多巴胺能神经元前体细胞增殖的结果就是多巴胺前体神经元的增加，ngn1是多巴胺能神经元的标记物。
　　结论：
　　本课题使用斑马鱼作为模式生物，首次研究了Zdhhc15b在斑马鱼体内的时空表达模式。结果显示，Zdhhc15b在斑马鱼间脑高表达，并呈现阶段特异性。注射吗啉代寡核苷酸建立Zdhhc15b下调模型，发现Zdhhc15b下调导致斑马鱼腹侧间脑区域成熟的多巴胺能神经元减少，从而导致间脑发育缺陷以及相应的学习认知障碍。进一步的研究发现，下调斑马鱼Zdhhc15b表达影响斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的分化。Zdhhc15b下调后foxA2，lmx1a和pitx3表达量降低。由此得出结论，Zdhhc15b可能通过Shh和Wnt/β-catenin信号通路召募一系列的多巴胺能神经元分化相关转录因子影响多巴胺能神经元分化。也就是说通过调节多巴胺能神经元的分化，Zdhhc15b充当决定性因素，调节多巴胺能神经元前体细胞向成熟多巴胺能神经元命运的转化。本研究加深了对DHHC蛋白家族在神经发育中功能的理解，同时为多巴胺能神经元的发育的研究，特别是为多巴胺能神经元功能障碍引起的疾病（如阿尔茨海默和帕金森氏病等神经系统疾病）的研究和临床治疗提供了新的线索。
　　第二章 bupropion对斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的增殖和保护作用
　　目的：
　　抑郁症是一种常见的具有高发病率、高复发率和高致残率等特点的精神疾病。抑郁症发病率近年来有逐渐增高的趋势，在普通人群中的发病率男性为5％～12％，女性为10％～25％。抑郁症已经成为威胁人们心身健康的一大隐患。
　　Bupropion是一种氨基酮类新型抗抑郁药物。随着对bupropion的深入研究也陆续发现了其在戒烟、改善酒精依赖、注意缺陷多动障碍(attention deficithyperactive disorder，ADHD)等疾病方面的治疗作用。尽管有这些重要进展，其作用机制尚未完全了解。此外，有研究表明抗抑郁药可能会通过促进神经元再生增加神经元数目达到治疗抑郁症的目的。众所周知，多巴胺能神经元与抑郁症的发生密切相关，那么bupropion对多巴胺能神经元有什么作用，其机制是什么是本课题研究的科学问题。
　　本研究用斑马鱼作为模式生物，建立多巴胺能神经元的MPTP（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）损伤模型，分别从体内、体外两个方面通过胚胎整封原位杂交(Whole-mount in situ hybridization，WISH)、整封免疫荧光、细胞免疫组化、行为学检测等方法研究了bupropion对斑马鱼多巴胺能神经元的作用，并深入探讨了其机制。
　　方法：
　　为了检测bupropion对多巴胺能神经元是否有作用，本课题首先建立了多巴胺能神经元的MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)损伤模型。实验分为对照组、MPTP(5μg/mL)、bupropion（100、300μM）+MPTP组。
　　鉴于bupropion处理后TH+/DAT+神经元的数目的增加，这促使本文检测定bupropion对多巴胺能神经元是否有保护作用。为此，在斑马鱼胚胎发育24hpf和48hpf时期进行吖啶橙染色实验。结果显示，与对照组相比，MPTP损伤组的多巴胺能神经元凋亡数目增多，而bupropion处理组的多巴胺能神经元的凋亡数目比MPTP损伤组明显减少。提示bupropion对多巴胺能神经元具有保护作用。
　　结论：
　　抑郁症发病机制及抗抑郁药物主要治疗机制目前还不清楚，而且由于缺乏人类临床研究，这是目前面临的一个重大科学问题。本研究发现bupropion具有保护和促进多巴胺能神经元再生的作用，这将深化人们对bupropion作为抗抑郁药物的治疗机制的认识。同时，bupropion对多巴胺能神经元的再生可能为抑郁症或相关精神疾病的治疗提供新的靶标。此外，对参与多巴胺能神经元发育的细胞及分子机制的全面了解，将大大推动对抑郁症的治疗和多巴胺能神经元功能障碍引起的其他精神疾病的药物治疗。

目录

声明

摘要

前言

研究意义

符号说明

第一章 Zdhhc15b基因调节斑马鱼胚胎间脑多巴胺能神经元分化的研究

背景介绍

第一部分 Zdhhc15b在斑马鱼间脑发育过程中的作用

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分 Zdhhc15b对斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元发育的影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

第三部分 Zdhhc15b调节多巴胺能神经元分化的机制研究

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

第二章 bupropion对多巴胺能神经元的增殖和保护作用

背景介绍

第一部分 bupropion对MPTP引起的多巴胺能神经元数目减少及功能障碍的改善作用

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

第二部分 bupropion对斑马鱼腹侧间脑多巴胺能神经元的增殖和保护作用

实验材料

实验方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

综述1 DHHC蛋白在神经发育过程中的作用

综述2 斑马鱼多巴胺能神经元的发育分化

英文论文1

英文论文2