CSF1对结肠癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞相互作用的影响及瘦素对人绒毛外滋养细胞侵袭活性的调节及相关机制研究

摘要

组织微环境与疾病是当今生命科学的热点领域，肿瘤生物学、肿瘤免疫学及干细胞等医学前沿领域研究的飞速发展，有赖于对特定组织微环境及其调控机制的诠释。受不同生理及病理生理的刺激，组织微环境的动态平衡可被打破，构成微环境的组分可发生变化并改变构成细胞的生物学特性，参与机体的许多生理及病理过程与疾病的发生。如妊娠早期大量免疫细胞浸润母体的蜕膜组织，同时局部的细胞因子及趋化因子表达谱发生显著的改变，此特定组织微环境的变化是保障妊娠成功的关键。而肿瘤发生过程中的独特微环境，如浸润的免疫细胞群体、局部独特的细胞因子及趋化因子表达等，在控制肿瘤细胞的侵袭转移及逃逸机体免疫打击中起着作用。因此，从微环境概念入手阐述特定微环境的构成及改变的机制，对特定生物学行为及相关疾病的转归与治疗策略的发展具有重要意义。
　　巨噬细胞集落刺激因子(CSF1)是一种与巨噬细胞关系极为密切的多能细胞因子，在巨噬细胞的分化、极化和趋化过程中均发挥重要的调节作用。目前已在许多类型肿瘤，如乳腺癌、肝癌、胶质瘤等中发现CSF1及其受体CSF1R高表达，在肿瘤内的表达水平与巨噬细胞浸润数量呈正相关。结直肠癌患者外周血CSF1水平约为健康人的两倍左右，且与淋巴结转移和肿瘤标志物(CEA、CA19-9)水平存在相关性。然而我们尚不清楚促进结直肠癌患者CSF1高度表达的调节机制，以及CSF1在结直肠癌发展中的意义。结直肠癌是一种免疫敏感性肿瘤，肿瘤局部浸润免疫细胞的数量及活性与患者预后密切相关。其中巨噬细胞是肿瘤间质中数量最多的细胞群体，可达肿瘤组织细胞总数的50％以上。巨噬细胞具有造血系统中最强的可塑性，根据外界环境因素可分化为抑瘤或促瘤两种功能相反的细胞亚群。结直肠癌浸润的巨噬细胞是否对肿瘤局部CSF1水平起调节作用？CSF1是否通过影响巨噬细胞功能参与结直肠癌的发生发展？基于以上问题，我们探究了结肠癌患者中CSF1的表达及其临床意义，并分析了结肠癌局部高CSF1微环境形成的调节机制。在此观察结果的基础上，利用体外实验和动物模型进一步探究肿瘤高CSF1微环境对巨噬细胞迁移和细胞因子分泌等生物学功能的影响。此外，我们发现褐藻多糖影响CSF1在巨噬细胞中的自分泌过程，从而对巨噬细胞的生物学活性产生调节作用。这将可能为CSF1介导的抗肿瘤免疫治疗提供新的辅助治疗手段。
　　妊娠早期蜕膜具有与肿瘤微环境相似的生物学特性，不仅存在多种类型的免疫细胞浸润和“免疫赦免”状态，还具有与肿瘤相似的高度侵袭活性。绒毛外滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts，EVT)是微环境中发挥主要侵袭作用的细胞类型，但其侵袭活性受到严格的时间和空间限制。多种激素水平的变化是妊娠早期蜕膜微环境的显著特征之一，瘦素即为其中一种重要的妊娠相关激素。蜕膜组织中的多种类型细胞均分泌瘦素，妊娠早期机体外周血及妊娠局部瘦素水平显著升高。高瘦素状态是胚胎正常植入和妊娠维持的关键。妊娠早期EVT细胞高度表达瘦素受体，提示瘦素可能对其生物学行为发挥调节作用。为明确瘦素与妊娠早期蜕膜微环境高度侵袭特性之间的联系，我们利用体外实验模拟高瘦素微环境，并探究了外源性瘦素对人妊娠早期EVT细胞系侵袭活性的影响及其相关作用机制。
　　本课题选取了结肠癌及妊娠早期蜕膜这两个典型的病理或生理组织微环境作为研究对象，以探究结肠癌局部高CSF1微环境的形成机制，以及CSF1和瘦素对组织微环境中巨噬细胞和EVT细胞的侵袭、迁移、分化等多种生物学行为的影响。我们的研究为理解微环境构成和各组分间的相互调节作用提供了有价值的补充，有助于从以微环境为基础的创新角度入手，阐述特定生理现象或疾病进展的相关机制。
　　第一部分结肠癌来源的巨噬细胞集落刺激因子对结肠癌细胞与巨噬细胞相互作用的影响及相关机制
　　目的：
　　肿瘤浸润巨噬细胞是结直肠癌患者免疫疗法的潜在靶点。巨噬细胞集落刺激因子(CSF1)在巨噬细胞的募集和功能发挥中发挥重要的调节作用，但其在结肠癌局部的表达及在结肠癌发生发展中的作用仍未阐明。本研究将探讨结肠癌高CSF1微环境的形成机制，以及肿瘤来源的CSF1对结肠癌细胞与肿瘤浸润巨噬细胞相互作用的影响。此外，本研究还探讨了天然提取物褐藻多糖对巨噬细胞CSF1自分泌过程的影响，及CSF1自分泌对巨噬细胞生物学活性的调节作用。
　　方法：
　　1.通过免疫组化检测分析CSF1和CD68（巨噬细胞）在结肠癌组织中的表达情况及与结肠癌患者疾病状态和预后的相关性。
　　2.利用transwell小室构建结肠癌细胞与巨噬细胞体外间接共培养模型。采用qRT-PCR、ELISA等方法检测共培养对结肠癌细胞CSF1表达的影响。
　　3.采用qRT-PCR、ELISA、Western blotting等方法检测巨噬细胞分泌的IL-8对结肠癌细胞CSF1表达的影响和相关信号通路。
　　4.采用transwell小室及qRT-PCR等技术检测结肠癌细胞分泌的CSF1对巨噬细胞募集和分泌活性的影响。
　　5.建立裸鼠结肠癌CSF1过表达移植瘤模型。利用体内实验探究肿瘤来源CSF1对结肠癌发展和巨噬细胞浸润的影响。
　　6.探究自然提取物褐藻多糖对巨噬细胞迁移活性和细胞因子分泌的影响。
　　7.采用qRT-PCR及ELISA等方法检测褐藻多糖对巨噬细胞CSF1分泌的影响，并分析巨噬细胞分泌的CSF1对自身迁移和细胞因子分泌功能的调节作用。
　　结果：
　　1.免疫组化结果显示，与癌旁组织或正常腺体组织相比结肠癌肿瘤细胞CSF1表达水平明显增高。结肠癌及癌旁基质中CD68+细胞（巨噬细胞）数量显著多于正常结肠组织。CSF1高表达及巨噬细胞浸润与患者的肿瘤分期有关，是结肠癌患者预后的独立因素。
　　2.与巨噬细胞间接共培养促进结肠癌细胞CSF1的表达。
　　3.巨噬细胞分泌大量的IL-8，促进结肠癌细胞CSF1的表达和PKC信号通路的磷酸化水平。PKC信号通路的活化可促进结肠癌细胞CSF1的表达。
　　4.结肠癌细胞分泌的CSF1显著促进对巨噬细胞的募集，并调节巨噬细胞分泌因子表达谱，抑制促炎细胞因子的表达而促进抗炎细胞因子和趋化因子的表达。
　　5.裸鼠移植瘤模型中结肠癌细胞CSF1过表达促进巨噬细胞浸润并抑制移植瘤生长。
　　6.巨噬细胞分化过程中加入褐藻多糖，细胞形态发生明显改变，迁移能力和促炎细胞因子的分泌活性受到抑制。
　　7.褐藻多糖剂量依赖性抑制巨噬细胞CSF1的分泌。外源性CSF1显著减弱褐藻多糖对巨噬细胞迁移和分泌功能的抑制作用。
　　结论：
　　我们的研究分析了结肠癌高CSF1微环境形成的机制及在结肠癌发展中的关系，并首次证实CSF1是结肠癌细胞与巨噬细胞相互作用环路中的关键因子。结肠癌局部的CSF1不仅影响肿瘤浸润巨噬细胞的侵袭和分化，更影响整个肿瘤微环境的免疫状态，有希望成为结肠癌治疗中新的作用靶点。此外，我们发现CSF1在巨噬细胞中的分泌可通过外源性加入自然提取物褐藻多糖进行调节，以此改变机体的免疫细胞状态和免疫功能。这提示以CSF1为基础的免疫疗法可能在多种疾病如肿瘤的治疗中发挥重要的辅助作用。
　　第二部分瘦素对人妊娠早期绒毛外滋养细胞侵袭活性的调节及相关机制研究
　　目的：
　　人绒毛外滋养细胞(extravillous cytotrophoblasts，EVT)的侵袭活性受到严格的时间和空间限制。妊娠早期机体外周血瘦素水平显著升高，是胚胎正常植入和妊娠维持的关键因素。但高瘦素状态对EVT细胞的侵袭有何作用目前尚不清楚。本研究利用体外实验，探究瘦素对人妊娠早期EVT细胞侵袭活性的调节，并探究可能的作用机制。
　　方法：
　　1.采用transwell小室研究瘦素对人EVT细胞系侵袭活性的影响。
　　2.采用qRT-PCR、Western blotting等方法研究瘦素对人EVT细胞系MMP14表达的影响。向人EVT细胞系转染MMP14 siRNA干扰其表达。通过transwell小室研究MMP14在瘦素调节滋养细胞侵袭活性中的作用。
　　3.采用qRT-PCR、Western blotting等技术，探究瘦素对滋养细胞Notch1信号通路活性的影响。
　　4.向人EVT细胞系转染Notch1 siRNA干扰其表达，研究Notch1对滋养细胞MMP14表达的影响。利用transwell小室研究Notch1在滋养细胞侵袭活性中的作用。
　　5.通过Western blotting技术研究瘦素及Notch1受体对PI3K信号通路活性的影响，以及PI3K信号通路在滋养细胞MMP14表达中的作用。
　　结果：
　　1.瘦素促进人EVT细胞系的侵袭和MMP14的表达，MMP14参与瘦素调节的滋养细胞侵袭过程。
　　2.瘦素促进EVT细胞Notch1信号通路的活性。活化的Notch1信号通路参与瘦素调节的滋养细胞MMP14表达和侵袭过程。
　　3.Notch1信号通路参与瘦素对滋养细胞中PI3K信号通路的激活作用。活化的PI3K信号通路调节滋养细胞MMP14的表达
　　结论：
　　在此研究中，我们发现瘦素通过Notch1-PI3K-MMP14通路促进人EVT细胞系的侵袭活性。这一发现将为瘦素在妊娠早期蜕膜微环境中的生理功能及其作用机制提供有力补充，提示瘦素可能在子痫或肿瘤等侵袭异常相关疾病的发生发展与防治工作中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 结肠癌来源的巨噬细胞集落剌激因子对结肠癌细胞与巨噬细胞相互作用的影响及相关机制

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

图表

第二部分 瘦素对人妊娠早期绒毛外滋养细胞侵袭活性的调节及相关机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

图表

结论

创新性

参考文献

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