冰岛硫化叶菌中Holliday junction解离酶Hje的翻译后修饰相关研究

摘要

当细胞DNA发生损伤时，多种修复机制会启动进行损伤DNA的修复，其中同源重组(Homologous Recombination，HR)修复是较为精确的修复机制，在DNA双链断裂及停滞复制叉的修复中发挥着重要的作用。该修复途径中最关键的步骤之一是对重组中间体HJ(Holliday Junction)的处理，该过程可以通过解离酶进行。几种硫化叶菌如硫化叶菌硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus和冰岛硫化叶菌Sulfolobusislandicus中已经鉴定了两个解离酶:Hje和Hjc。其中Hjc在整个古菌中都是保守的，而Hje只在泉古菌中存在。
　　本实验室的前期研究发现，SDS-PAGE胶上显示古菌中表达和纯化得到的不加标签的Hje大小和大肠杆菌中纯化的Hje大小类似，而古菌中表达和纯化得到的Hje-C-His比大肠杆菌中表达和纯化的Hje-C-His要大2 kDa左右。真核生物中的解离酶通过翻译后修饰调控其功能，如Gen1、Yen1存在磷酸化与去磷酸化修饰，这种修饰会对解离酶的活性、在细胞中的定位或者是蛋白的大小造成影响。实验室先前对Hje-C-His过表达菌株的microarray分析发现，过表达Hje-C-His菌株中编码丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶SiRe_2056转录水平上升了3.25倍。综合这几点，我们推测古菌中解离酶Hje也可能存在这种修饰。
　　我们还发现，过表达Hje-C-His菌株生长明显受到抑制。Hje的C末端可能存在两个磷酸化位点:127位丝氨酸(S127)和134位苏氨酸(TTM)。首先，以E233S菌株为材料，构建该两位点突变成丙氨酸(A)和谷氨酸(E)的Hje突变体过表达菌株，并对Hje突变体蛋白的大小和突变体过表达菌株的生长进行测定。发现两位点突变成丙氨酸，突变体蛋白不再变大，并且过表达菌株的生长不受抑制，恢复正常;将两位点突变成谷氨酸，模拟体内磷酸化修饰，过表达菌株Sis/pSeSD-HjeT134E-C-His、Sis/pSeSD-HjeT134E-no-His的生长仍受抑制，而Sis/pSeSD-HjeS127E-C-His、Sis/ pSeSD-HjeS127E-no-His的生长却恢复正常不受抑制。体外生化实验证明除了HjeS127E-C-His活性有略微下降外，其它突变体的核酸酶活性没有变化。这间接证明T134位点很有可能是磷酸化修饰调控位点，对该位点的修饰可以调控核酸酶的活性。而S127也是一个重要的位点，也许与蛋白与蛋白的互作相关。
　　接下来，为了排除C端标签的添加可能对S127、T134的影响，构建N端加标签的菌株Sis/pSeSD-Hje-N-His，检测蛋白大小和菌株生长，发现Hje-N-His的大小为16 kDa，和不加标签的Hje大小类似，过表达菌株的生长也不受抑制。磷酸酶处理Hje-N-His蛋白后，Western验证发现蛋白大小不变。对真核生物中解离酶研究发现，该酶的翻译后修饰仅存在与特定的细胞周期中，以此类推，古菌中解离酶Hje的修饰也许仅存在于特定的周期中。所以我们推测体内Hje-N-His的磷酸化水平低于Hje-C-His。
　　真核生物中解离酶的翻译后修饰存在于特定的细胞周期中，对解离酶的翻译后修饰研究采用细胞同步化处理的方式。而古菌中很难进行细胞同步化，所以我们纯化出的Hje-N-His中处于修饰状态的蛋白比例很低，故用磷酸酶处理后蛋白大小不会变化。
　　为了获得更多的修饰状态的蛋白用来进行质谱鉴定，参考真核生物中研究方法用损伤剂MMS处理细胞。发现MMS处理后，Western可以检测到两种不同大小的Hje信号，所以我们推测Hje可能存在受MMS诱导的翻译后修饰，这种修饰影响蛋白大小。为了验证Hje的修饰类型和寻找Hje的互作蛋白，尝试通过免疫共沉淀的方法富集本底修饰状态的Hje。但是由于Hje本底水平含量太低，我们无法富集到高纯度的Hje。免疫共沉淀的方法仍然需要进行一些改进来获得修饰状态的Hje以进行质谱鉴定。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 古菌概述

1．1．1 古菌的发现及特点

1．2 硫化叶菌

1．2．1 硫化叶菌的概述

1．2．2 硫化叶菌的遗传表达系统

1．3 DNA损伤与修复途径

1．3．1 DNA损伤类型

1．3．2 DNA损伤修复途径

1．4 HJ解离酶

1．4．1 原核生物解离酶

1．4．2 真核生物解离酶

1．4．3 真核生物解离酶的调控机制

1．4．4 古菌解离酶

1．4．5 Hje前期研究进展

1．5 研究目的及意义

第2章 Hje突变体过表达菌株表型的分析

2．1 实验材料

2．1．1 菌株及培养基

2．1．2 材料

2．2 实验方法

2．2．1 目的蛋白的质谱鉴定

2．2．2 突变体质粒的构建

2．2．3 突变体质粒的电转化与过表达菌株单克隆的筛选

2．2．4 大肠杆菌中突变体蛋白的表达和纯化

2．2．5 古菌中突变体蛋白的表达和纯化

2．2．6 SDS-PAGE及Western blotting分析目的蛋白

2．2．7 生长曲线的测定

2．2．8 蛋白核酸酶活性的检测

2．3 结果与讨论

2．3．1 古菌中Hje(有无标签)蛋白的纯化

2．3．2 Hje突变体过表达菌株的筛选

2．3．3 Hje各突变体蛋白的表达和纯化

2．3．4 Western检测突变体蛋白的大小变化

2．3．5 各突变体过表达菌株生长曲线的测定

2．3．6 Hje各突变体核酸酶活性的体外检测

2．4 总结与讨论

第3章 Hje可能的翻译后修饰研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 磷酸酶处理实验

3．2．2 损伤剂MMS处理实验

3．2．3 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)富集目的蛋白

3．3 实验结果

3．3．1 菌株Sis／pSeSD-Hje-N-His的构建

3．3．2 古菌中Hje-N-His蛋白的表达、纯化

3．3．3 Sis／pSeSD-Hje-N-His生长曲线的测定

3．3．4 磷酸酶处理Hje-N-His、Hje-C-His蛋白

3．3．5 损伤剂MMS处理后Hje变化分析

3．3．6 免疫共沉淀富集古菌中修饰状态的Hje

3．4 总结与讨论

第4章 总结与展望

附录

参考文献

致谢