慢性HBV感染诱导miR-146a对NK细胞功能负调控机制及防治HBV疫苗新策略探究

摘要

研究目的：乙型肝炎病毒(HBV)的感染是威胁全人类健康的重大传染性疾病，目前全球有约3.5亿人感染乙肝病毒。由于HBV病毒本身的特点和治疗药物的相对匮乏和应用上的诸多局限，HBV感染人群中有三分之二是慢性乙肝患者，病毒的彻底清除十分困难，疾病迁延不愈引发的肝纤维化、肝硬化和肝癌等并发症更是患者健康的重大威胁。因此，乙肝发生发展的基础生物学和免疫治疗学一直是肝脏病学研究领域的重点。
　　研究表明，导致慢性乙肝患者长期携带病毒，对抗病毒药物应答不充分的关键原因之一是患者体内的免疫系统长期处于抑制和耐受状态。肝脏免疫学研究认为HBV病毒可在器官、细胞、分子等多个层次上抑制机体的抗HBV免疫反应。由于HBV病毒的有效清除离不开免疫系统的激活，所以打破和逆转HBV造成的免疫耐受状态，活化机体的抗病毒免疫应答是慢性乙肝治疗的重点和关键。
　　在抗HBV应答过程中，固有免疫是机体抵抗HBV感染的第一道防线。其中，NK细胞在HBV感染时能快速募集到感染部位，无需抗原递呈就能识别病毒感染的细胞并予以杀伤，在HBV感染早期发挥着快速清除病毒、防止病毒集聚和扩散的作用。而获得性免疫应答是机体抵抗HBV感染的中坚力量，尤其是HBV特异性CD8+T细胞，是清除肝细胞内HBV cccDNA最主要的免疫细胞。然而持续的HBV复制损害了CD8+T细胞的功能，抑制了NK细胞的杀伤活力，同时削弱了它们分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子的能力，这两大类细胞毒性淋巴细胞功能的缺失严重延迟了患者体内病毒的清除速度，影响了慢性乙肝的转归。
　　本研究的目的是从固有免疫成员NK细胞和获得性免疫成员T细胞两方面着手，探索慢性乙肝耐受的机制及新治疗策略。一方面，我们以CHB患者为对象，在表观遗传学层面上研究HBV感染过程中miR-146a调控NK细胞功能的机制。我们发现miR-146a在NK细胞免疫应答中发挥负调作用，描绘了miR-146a在NK中受到调节的基本路径和发挥作用的靶分子;通过靶向调控miR-146a的表达可增强NK细胞的功能，达到治疗慢性乙肝的目的。这部分旨在通过改善固有免疫应答来针对性地治疗慢性乙肝，为设计开发基于miRNA的新型慢性乙肝治疗药物提供理论依据。另一方面，我们设计并验证了一种新的乙肝疫苗及其免疫接种策略，采用淋巴结定向注射HBsAg的方法，以促进抗原与抗原递呈细胞的充分接触为目的，增强机体对疫苗的免疫应答，从而提高机体抗HBV获得性免疫应答和免疫记忆的形成。我们利用HBV模型小鼠对这种疫苗的治疗效果进行了检测和评价，并探索了其发挥作用的免疫学机制，并且淋巴结定向注射HBsAg的方法也可以用于预防性疫苗，从而为慢性乙肝的防治提供一种新的技术手段。
　　研究方法：第一部分 miR-146a通过靶向STAT1负调NK功能。
　　首先，我们运用MACS磁珠分选CHB和HCC患者外周血中NK细胞，流式细胞术确定细胞纯度后，利用LDH法检测NK细胞对肝癌细胞系HepG2细胞的杀伤活性，同时运用实时定量PCR检测这些NK细胞中miR-146a的表达水平。在初步看到miR-146a的作用后，构建miR-146a过表达、抑制及其对照的慢病毒载体，通过慢病毒感染的方法将miR-146a过表达及抑制载体转入NK-92细胞系或者原代NK细胞，经嘌呤霉素筛选一周后通过流式细胞术检测细胞阳性率，通过定量PCR检测过表达效率。而原代NK细胞则是在感染24小时后进行后续实验，不经嘌呤霉素筛选。我们对构建成功的miR-146a过表达及抑制的NK-92细胞系进行基本表型及功能的检测，MTT法检测细胞增殖，流式检测细胞周期及凋亡，CFSE/7AAD法检测细胞NK-92细胞对HepG2细胞的杀伤能力，流式细胞术检测细胞表面受体及杀伤相关分子perforin、IFN-γ、TNF-α等表达水平。
　　然后，在明确miR-146a的抑制作用后我们寻找诱导miR-146a表达的因素。我们用HepG2细胞及其培养上清、CHB及HCC患者外周血清、抑制性细胞因子IL-10/IL-6/TGF-β、活化性因子polyI∶C/IL-12/IL-15/IFN-α分别与NK细胞孵育，并用定量PCR检测NK细胞中miR-146a的表达。
　　在寻找NK细胞中miR-146a靶基因时，我们首先通过生物信息学预测新的靶基因，通过RIP实验和荧光素酶报告基因实验进行证实;同时，对已经报道的靶基因，通过western检测这些基因在miR-146a过表达及抑制的NK-92细胞中的表达水平。确定了miR-146a的靶基因为STAT1后，用IFN-α和Fludarabine分别刺激和抑制STAT1的磷酸化，检测STAT1通路活化或抑制后NK细胞杀伤活性。CFSE/7AAD法检测NK-92细胞对HepG2细胞的杀伤活性，LDH法检测原代NK细胞对HepG2细胞的杀伤活性。
　　最后，分选CHB、HCC患者外周血NK细胞，体外加IL-12/IFN-α/IFN-β孵育细胞模拟临床细胞因子治疗CHB或HCC的过程，流式细胞术检测NK细胞表面CD107a表达水平，定量PCR检测细胞表面miR-146a的表达水平。
　　第二部分淋巴结定向注射HBsAg用于防治慢性HBV感染的研究
　　首先我们通过尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒的方法建立HBV持留小鼠模型，断尾取血，ELISA方法检测血清中HBsAg水平以确定HBV阳性小鼠。淋巴结内注射HBsAg来治疗HBV感染，共治疗三次，每次间隔一周，并且自治疗前一天开始每隔一周断尾取血一次，收集血清。ELISA方法检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平以观测HBV清除的程度。淋巴结注射后取小鼠淋巴结，肉眼及HE染色观察淋巴结组织状况，以此判断这种注射方式是否对组织造成损伤。免疫组织化学分析小鼠肝组织中HBcAg的表达。进一步提取小鼠肝脏、脾脏、淋巴结、外周血中淋巴细胞，细胞计数仪计数，通过流式细胞术检测细胞表面分子标志以确定各细胞亚群的变化。另外，淋巴细胞分离后在体外培养，加PMA和离子霉素刺激，加BFA抑制蛋白转运，然后通过流式细胞术检测胞内分子表达。
　　研究结果：第一部分 miR-146a通过靶向STAT1负调NK功能。
　　1.人CHB和HCC患者外周血NK细胞杀伤功能受到抑制
　　分选出CHB和HCC患者外周血NK细胞，检测其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性，检测发现与健康志愿者相比，CHB和HCC患者NK细胞对HepG2细胞杀伤活性明显降低。
　　2.CHB及HCC患者外周血NK细胞中miR-146a表达水平升高
　　分选出CHB和HCC患者外周血NK细胞，定量PCR检测结果显示，与健康志愿者相比，CHB和HCC患者外周血NK细胞中miR-146a表达水平升高，并且miR-146a表达水平与NK细胞的杀伤活性呈负相关。
　　3.miR-146a过表达/抑制的NK-92细胞系的建立
　　NK-92感染病毒后用嘌呤霉素成功筛选出miR-146a过表达及抑制的NK-92细胞系（NK92-146a-over、NK92-146a-inh和NK92-NC），检测发现miR-146a过表达细胞中miR-146a表达升高10倍。MiR-146a过表达慢病毒感染原代NK细胞24小时，检测到细胞中miR-146a表达可升高约2.5倍。
　　4.miR-146a抑制NK细胞的功能
　　对NK92-146a-over及NK92-146a-inh细胞系的基本性质和功能进行检测，结果miR-146a不影响NK细胞的增殖、周期、凋亡，不改变NKG2A/NKG2D/NKp30/NKp44/NKp80受体的表达，但是miR-146a能够抑制NK细胞的杀伤活性，抑制其分泌细胞因子的能力。体外抑制CHB和HCC患者NK细胞中miR-146a，可以恢复NK细胞杀伤功能。
　　5.细胞因子IL-10及TGF-β促进NK细胞miR-146a的表达
　　将NK细胞与HepG2细胞共孵育后发现NK细胞中miR-146a表达明显升高，当NK细胞与HepG2以transwell非接触形式共孵育时，NK细胞中miR-146a升高的程度降低，这说明HepG2表面分子及分泌的细胞因子都能促进miR-146a的表达。
　　用CHB及HCC患者血清分别孵育NK细胞，细胞中miR-146a表达明显升高，进一步用细胞因子IL-10/IL-6/TGF-β孵育NK细胞，发现IL-10和TGF-β能够诱导NK细胞miR-146a的表达。
　　6.NK细胞中miR-146a调控的靶分子的确定
　　在软件预测及RIP实验中均发现TRAIL可能是miR-146a的靶基因，但是荧光素酶报告基因实验否定了该结果，实验证实TRAIL并不是miR-146a在NK细胞中的直接靶基因。Western blot实验结果显示STAT1的表达在miR-146a过表达的NK-92细胞系中升高，在miR-146a抑制的NK-92细胞系中下降，提示NK细胞中STAT1是miR-146a的靶基因。
　　7.miR-146a通过靶向STAT1调控NK细胞的功能
　　STAT1活化后，NK杀伤活性增强，STAT1抑制后，NK细胞杀伤活性降低。并且在Fludarabine抑制STAT1后，miR-146a对NK-92细胞的抑制作用不明显，说明miR-146a通过靶向STAT1调控NK细胞的功能。
　　8.在临床应用细胞因子治疗CHB和HCC中可以通过影响miR-146a来改善NK细胞的功能
　　分选CHB和HCC患者外周血NK细胞，体外用IFN-α等细胞因子刺激模拟临床用细胞因子治疗CHB和HCC的过程，发现细胞因子处理能显著抑制miR-146a的表达水平并且NK细胞杀伤标志CD107a表达升高，因此，对miR-146a表达进行干扰能够改善NK细胞的功能。
　　第二部分淋巴结定向注射HBsAg用于防治慢性HBV感染的研究
　　1.HBV慢性感染小鼠模型的建立及免疫耐受状态的检测
　　成功建立HBV持留小鼠模型，对脾脏淋巴细胞的检测发现，表达成熟分子CD80/CD86的DC比例下降，而表达抑制性分子PD-1的T细胞比例升高。
　　2.淋巴结注射对组织结构的影响
　　肉眼观察及HE染色均显示，淋巴结注射生理盐水不影响淋巴结的大小和结构，说明淋巴结注射不会造成组织损伤。
　　3.淋巴结注射对慢性HBV感染的治疗效果优于肌肉注射市售疫苗
　　淋巴结注射HBsAg能够降低HBV小鼠外周血中HBsAg水平，而肌肉注射市售疫苗对慢性HBV感染没有治疗作用。
　　4.淋巴结注射HBsAg与注射NS相比有明显的治疗效果
　　与淋巴结注射生理盐水相比，注射HBsAg能显著降低外周血HBsAg水平，且能降低肝脏内HBcAg的水平。
　　5.淋巴结注射HBsAg治疗慢性乙肝的机制
　　淋巴结注射HBsAg明显增加小鼠淋巴结中淋巴细胞的数目，淋巴结中DC细胞数量明显增加，且表达成熟分子CD80/CD86/CD40的DC比例增加;成熟DC诱导体内记忆细胞增殖分化，产生出大量的HBV特异性的效应性T细胞，发挥清除HBV的作用。
　　6.淋巴结注射HBsAg对HBV感染的预防作用
　　与肌肉注射相比，淋巴结注射HBsAg诱导产生的抗体较弱，但是依然能有效地抑制HBV的感染，并且能够长期预防HBV的感染。进一步的研究证实，淋巴结注射HBsAg诱导体内更多的中枢记忆性T细胞出现，在再次遇到HBV感染时这些记忆细胞分化为大量的效应细胞达到清除HBV的目的。
　　结论：本研究发现，CHB患者外周血NK细胞杀伤活性的降低与NK细胞中miR-146a的高表达有关。高表达的miR-146a通过靶向STAT1分子抑制了NK细胞的杀伤活性及分泌细胞因子的能力。而CHB患者血清中含有高水平的IL-10和TGF-β，这些免疫抑制因子可以诱导NK细胞中miR-146a的表达。在CHB以及HCC治疗中使用IFN-α/IL-12等激活性细胞因子，可以抑制NK细胞的miR-146a，或者使用特异性阻遏物封闭内源性miR-146a都能够有效恢复NK细胞抗感染和抗肿瘤能力。
　　淋巴结注射HBsAg能够降低慢性HBV模型小鼠外周血中HBsAg及肝内HBcAg的水平，对清除慢性HBV感染有显著效果。机制研究证明，淋巴结注射HBsAg能够募集大量的DC到淋巴结并促进DC的成熟，大量成熟的DC细胞通过递呈抗原诱导体内记忆细胞分化为更多的HBV特异性效应T细胞，发挥清除病毒的作用。另外，进一步的研究证实，淋巴结注射HBsAg能够有效的预防HBV感染，并且预防作用不依赖于抗体的产生，而是依赖记忆性T细胞和效应性T细胞的产生。
　　意义：免疫细胞处于耐受状态，免疫系统功能低下是慢性乙型病毒性肝炎难以治愈的根本原因。本研究从固有免疫和获得性免疫两方面寻找慢性乙肝治疗策略。一方面，我们发现慢性HBV感染中NK细胞功能的异常与miR-146a相关，探讨了miR-146a对NK细胞功能的负调作用，并且通过抑制miR-146a能够增强NK细胞的杀伤功能。另一方面，我们通过改变免疫途径设计了一种新型的乙肝治疗策略，即淋巴结注射HBsAg，并且评价了该疫苗用于防治HBV感染的作用，分析了其作用机制。这些研究结果将为临床治疗及疫苗研发提供新的方向和理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语

第一部分 文献综述

综述一：慢性HBV感染中免疫系统的耐受及免疫治疗策略

一、HBV感染现状

二、慢性HBV感染过程中免疫系统的作用及免疫耐受机制

三、慢性HBV感染的治疗策略

综述二：调控NK的微小RNA分子

一、miRNAs调控NK发育和成熟

二、调控NK功能的miRNAs

三、其他(与NK细胞瘤相关的miRNAs)

第二部分 miR-146a通过靶向STAT1负调NK功能

前言

材料和方法

一、主要材料及试剂

二、主要试剂配置

三、主要仪器设备

四、主要实验方法

结果

一、人CHB及HCC患者外周血NK细胞杀伤功能抑制

二、CHB及HCC患者外周血NK细胞miR-146a表达水平升高

三、miR-146a过表达／抑制的NK-92细胞的建立

四、NK细胞中miR-146a的功能

五．细胞因子IL-10及TGF-β促进NK细胞miR-146a的表达

六、NK细胞中miR-146a调控的靶分子的确定

七．miR-146a通过靶向STAT1调控NK细胞的功能

八、临床细胞因子治疗CHB和HCC可以通过影响miR-146a来改善NK细胞的功能

讨论

第三部分 淋巴结定向注射HBsAg用于防治慢性HBV感染的研究

前言

材料和方法

一、主要实验材料

二、主要实验试剂的配制与保存

三、主要实验仪器

四、主要实验方法

结果

一、HBV持留小鼠模型的建立及免疫耐受状态的检测

二、淋巴结注射对组织结构的影响

三、淋巴结注射HBsAg对慢性HBV感染的治疗效果优于肌肉注射市售疫苗

四、淋巴结注射HBsAg与注射NS相比有明显的治疗效果

五、淋巴结注射HBsAg治疗慢性乙肝的机制

六、淋巴结注射HBsAg对HBV感染的预防作用

讨论

参考文献

本文创新点及意义

附录

攻读学位期间获得奖励情况

攻读学位期间参加学术会议的情况

攻读学位期间发表的学术论文

致谢