黑根霉胞外多糖对MNNG致小鼠慢性萎缩性胃炎的抑制作用

摘要

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)是一种常见的消化系统疾病，该病症严重影响患者的消化功能。CAG的发生伴随肠上皮化生和异型性增生，此二者在临床上是胃癌癌前病变的重要指标。目前临床上治疗CAG的药物只能消除胃黏膜病变部位的炎症和缓解疼痛，多数治疗药物存在药物依赖和损伤其它器官等不良反应。因此，寻找治疗效果显著、毒副作用小且能提高机体免疫能力的药物具有重要意义。
　　真菌多糖具有抗氧化、抗炎症、提高机体免疫能力等活性。黑根霉（Rhizopusnigricans）是一种接合菌类丝状真菌，在液体发酵过程中可产生大量胞外多糖。在前期研究中，本课题组从黑根霉发酵液中分离出粗多糖EPS，在体外可抑制人结肠癌HCT-116细胞及人白血病K562细胞的增殖。EPS可以通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。EPS也能够抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长，提高小鼠免疫能力，延长S180荷瘤小鼠的存活时间。
　　本研究通过建立CAG小鼠模型，研究EPS对由1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)诱导小鼠CAG的作用。
　　1.EPS治疗给药对MNNG诱导小鼠的作用，实验选取5周龄雄性BALB/c小鼠并随机分为对照组、MNNG组（MNNG66.7 mg/kg/d）和MNNG+EPS组(MNNG66.7 mg/kg/d、EPS75 mg/kg/d)，每组5只，实验进行20周后测定相关指标。实验结果表明，第20周，MNNG组小鼠平均体重（28.3+0.9 g）及进食量(168.5 g)小于对照组小鼠平均体重（34.4±1.1 g）及进食量(189 g); MNNG+EPS组小鼠平均体重（30.0±0.8 g）及进食量(174 g)大于MNNG组。小鼠胃组织和肝组织病理学检查结果表明，对照组小鼠胃黏膜腺体完整，肝组织细胞完整、形态规则无细胞间隙;MNNG组小鼠胃腺体萎缩并伴有胃黏膜肌层增生现象，胃内出现多处出血点，肝组织细胞形态不规则，细胞间隙较大;MNNG+EPS组小鼠胃黏膜仅出现黏膜充血未出现明显肌层增生现象，多数肝细胞形态完整，细胞间隙较小。小鼠免疫器官指数测定结果表明，MNNG组胸腺指数（0.59+0.002 mg/g）和脾脏指数（3.49+0.02 mg/g）小于对照组，该组小鼠免疫能力降低;MNNG+EPS组胸腺指数（0.68±0.002 mg/g）(P＜0.05)和脾脏指数（3.55±0.02 mg/g）均高于MNNG组。各组小鼠肝肾功能检测结果表明，MNNG组天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase，AST)含量（163.0+13.5 U/l）低于对照组，MNNG+EPS组AST含量（183.0±40.0 U/l）高于MNNG组;血清肌酐(Serumcreatinine，Cr)含量（31.4+4.67 mg/dl）和血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)含量（11.0+0.99 mg/dl）高于对照组;MNNG+EPS组MNNG组Cr(28.8+8.41 mg/dl)和BUN（9.5+1.17 mg/dl）含量低于MNNG组。上述结果说明，EPS多糖治疗给药方式可有效抑制小鼠CAG的发生和病症的发展。
　　2.EPS预防给药对MNNG诱导小鼠CAG的作用，实验选取5周龄雄性BALB/c小鼠并随机分为对照组、MNNG组(MNNG133 mg/kg/d)和MNNG+EPS组（MNNG133 mg/kg/d、EPS200 mg/kg/d），每组8只，实验前2周MNNG+EPS组小鼠仅饮用EPS水溶液，其他组别自由饮水，2周之后再按照上述方法进行实验，并持续到第20周，之后测定相关指标。小鼠体征及外观形态观察结果表明，对照组小鼠体型肥硕，背毛浓密有光泽，无竖毛现象，四肢抓握力量大;MNNG组小鼠体型瘦小，背毛稀疏存在竖毛现象，四肢几乎无抓握能力;MNNG+EPS组小鼠体型适中，背毛浓密无光泽无竖毛现象，四肢抓握力量小。各组小鼠胃黏膜溃疡指数评定分级结果表明，对照组患中、重度CAG的小鼠比例为0/8，MNNG组患中、重度CAG的小鼠比例为5/8，MNNG+EPS组患中、重度CAG的小鼠比例为2/8。各组小鼠胃组织细胞中与CAG形成相关基因COX-2和EGF mRNA表达量差异结果表明，对照组COX-2和EGF表达量较低，MNNG组COX-2和EGF的表达量要高于对照组，MNNG+EPS组COX-2和EGF表达量低于MNNG组但高于对照组。上述结果说明，EPS多糖预防给药方式可有效抑制小鼠CAG的发生和病症的发展，实验结果与治疗给药方式结果大致相同。
　　3.磺酰罗丹明B（SRB）染色法探究EPS对MNNG处理人肝细胞的影响。利用不同剂量的EPS(0.1、0.3、0.5 mg/mL)与MNNG(0.05 mg/mL)共同孵育人肝细胞20 h。实验结果表明，EPS能够提高肝细胞活性，并存在EPS剂量依赖关系。不同剂量的EPS与肝细胞共同孵育不会抑制肝细胞的生长和增殖。
　　综上所述，EPS可以在体外保护MNNG导致的肝细胞损伤，能够抑制小鼠CAG的形成，提高小鼠免疫能力，抑制MNNG对小鼠肝、肾脏器的损伤。

目录

声明

摘要

本文缩略词

1 前言

1．1 引起慢性萎缩性胃炎发病的因素

1．1．1 幽门螺杆菌感染

1．1．2 胆汁反流

1．1．3 高盐和低维生素的饮食习惯

1．1．4 遗传因素

1．1．5 其他因素

1．2 慢性萎缩性胃炎的发病特点

1．3 慢性萎缩性胃炎与胃癌的关系

1．4 慢性萎缩性胃炎的临床检查方法

1．4．1 胃镜检查

1．4．2 常规检查

1．4．3 组织活检检查

1．4．4 影像学检查

1．5 慢性萎缩性胃炎的治疗方法

1．6 建立慢性萎缩性胃炎动物模型的常见方法

1．6．1 幽门螺杆菌感染造模法

1．6．2 化学制剂诱导造模法

1．6．3 混合造模法

1．7 以MNNG作为诱导物建立慢性萎缩性胃炎动物模型的理论依据

1．8 多糖治疗慢性萎缩性胃炎的研究进展

1．9 真菌多糖的研究前景及挑战

1．10 黑根霉胞外多糖的研究进展

1．11 本实验课题研究的意义

2 实验试剂与仪器

2．1 实验动物及细胞

2．2 实验材料与试剂

2．3 实验仪器

3 实验方法

3．1 黑根霉胞外多糖提取及纯化

3．2 黑根霉胞外多糖含量测定

3．3 溶液的配制

3．4 治疗给药实验

3．5 预防给药实验

3．6 小鼠体重及进食量变化

3．7 小鼠脏器指数测定

3．8 小鼠胃组织及肝组织病理学分析

3．8．1 小鼠胃黏膜形态病理分析

3．8．2 HE染色法对小鼠胃、肝组织进行病理分析

3．9 小鼠肝肾功能分析

3．10 半定量PCR检测各组小鼠胃组织细胞中COX-2和EGF基因的mRNA表达水平

3．10．1 总RNA的提取

3．10．2 cDNA的合成

3．10．3 引物设计

3．10．4 PCR反应

3．10．5 琼脂糖凝胶电泳

3．11 小鼠外观状态与体征变化

3．12 小鼠体温测定

3．13 小鼠胃组织病理学评定

3．14 磺酰罗丹明B染色法检测EPS及EPS和MNNG对人肝细胞的影响

3．15 数据统计处理

4 实验结果与分析

4．1 黑根霉胞外多糖治疗给药对MNNG诱导慢性萎缩性胃炎的抑制作用

4．1．1 黑根霉胞外多糖含量测定结果

4．1．2 小鼠体重及进食量变化统计结果

4．1．3 小鼠胸腺指数及脾脏指数测定结果

4．1．4 小鼠胃黏膜形态变化分析

4．1．5 小鼠胃组织及肝组织病理学分析

4．1．6 小鼠血清中AST、Cr及BUN测定结果

4．1．7小 鼠胃组织COX-2和EGF基因的mRNA表达水平

4．2 黑根霉胞外多糖预防给药对MNNG诱导慢性萎缩性胃炎的抑制作用

4．2．1 小鼠外观状态及体征变化结果分析

4．2．2 小鼠体温测定结果

4．2．3 小鼠胃黏膜溃疡指数分级评定结果

4．2．4 小鼠胃组织及肝组织病理学分析

4．2．5 小鼠胃组织COX-2和EGF基因mRNA表达水平

4．3 EPS对由MNNG引起人肝细胞损伤的保护作用

5 讨论

5．1 黑根霉胞外多糖对慢性萎缩性胃炎的抑制作用

5．2 推测黑根霉胞外多糖抑制慢性萎缩性胃炎形成的机制

6 小结

参考文献

致谢