高脂血症大鼠种植体早期骨结合界面的微观分析及分子机制探究

摘要

目的:
　　研究高脂血症大鼠种植体早期骨结合界面的微观形态和微观成分，并探究其与Dishevelled-2(DVL2)相关的可能的分子机制。
　　方法:
　　(1).Wistar大鼠60只，均为雄性，依照随机原则，分为实验组和对照组分别以高脂饲料和普通饲料喂养。
　　(2).12周后，检测实验组大鼠血脂水平，去除实验组中不符合高脂血症标准的大鼠以及对照组中血脂异常的大鼠。在全麻下分别将一枚种植体植入，两组大鼠左右两侧股骨干骺端。在种植体植入后的1天、3天和5天分别处死一批大鼠，取出含有种植体的骨组织（图1），分别进行不同的检测。
　　(3).种植体植入后1天和5天的标本固定包埋后制作硬组织切片，分别进行光学显微镜和和扫描电镜(scanning electronic microscopy, SEM)观测，分析种植体早期骨结合界面的微观形态的动态变化。光学显微镜观测种植体周围的成骨细胞、破骨细胞和骨小梁;SEM进一步在高倍镜下，观测种植体周围的成骨细胞、破骨细胞和骨质状况。
　　(4).种植体植入后1天和5天的标本固定包埋后制作硬组织切片，在种植体中部1/3，沿种植体向组织方向，以10μm为间隔依次选“1～6”六个微区（图2），通过X射线能谱仪（energy dispersive X-ray spectrometer, EDS）分析种植体早期骨结合界面的微观成分的动态变化，进行钙、磷、氧和钛元素定量测定;计算Ca/P原子个数百分比。
　　(5).1天、3天和5天的标本，一部分液氮冻存通过荧光定量PCR(relativefluorescence quantitative polymerase chain-reaction，RT-PCR)检测种植体周围1mm骨组织中DVL2基因的表达情况;另外一部分，迅速提取蛋白，通过Western Bolt检测种植体周围1mm骨组织中DVL2蛋白和磷酸化的DVL2蛋白的表达情况。
　　结果:
　　(1).光学显微镜分析发现，种植体植入后的1～5d，种植体周围的成骨细胞和破骨细胞逐渐增多。实验组骨质疏松，骨小梁稀疏、排列紊乱;对照组骨质致密。实验组种植体周围的成骨细胞少于对照组（P＜0.05），破骨细胞多于对照组(P＜0.05)。
　　(2).SEM观测到的结果与光学显微镜相似，在种植体植入后的1～5 d，种植体周围的成骨细胞和破骨细胞逐渐增多。实验组骨质疏松，对照组骨质致密。实验组种植体周围的成骨细胞少于对照组，破骨细胞多于对照组。
　　(3).实验组Ca/P原子个数百分比低于对照组（P＜0.05），O元素的原子百分比高于对照组（P＜0.05）;由种植体至骨组织Ti元素的原子百分比逐渐减少，实验组和对照组各取样微区内的Ti元素原子百分比无明显差异。实验组和对照组的“5、6”取样微区的Ca/P原子个数百分比，均随时间的增加而减少，并且“5”取样微区的Ca/P原子个数百分比略小于“6”取样微区的Ca/P原子个数百分比;“4”取样微区的Ca/P原子个数百分比，随种植体植入时间的增加而略增加。“1、2、3”取样微区均未检测到Ca、P元素。实验组和对照组的“5、6”取样微区的O元素原子百分比，随种植体植入时间的增加而略增加，并且“5”取样微区的O元素原子百分比大于“6”取样微区的O元素原子百分比;“4”取样微区的O元素原子百分比，随种植体植入时间的增加而略微减少。“1、2、3”取样微区均未检测到O元素。实验组和对照组的“6”取样微区未检测到Ti元素，“1、2、3、4、5”取样微区的Ti元素原子百分比逐渐减少，“4、5”取样微区的Ti元素原子百分比，表现出随种植体植入时间的增加而稍减少的趋势;“1、2、3”取样微区的Ti元素原子百分比，随种植体植入时间的增加而略增加。
　　(4).实验组的DVL2基因的表达水平不及对照组（P＜0.05）。实验组DVL2的mRNA的表达水平在1-3天呈现下降趋势，在3-5天内呈现出上升趋势(p＜0.05);对照组DVL2的mRNA的表达水平在1-3天以内略微上升，在3-5天内略微下降。
　　(5).DVL2蛋白的表达水平与DVL2的mRNA的表达水平相似。实验组的DVL2蛋白的表达水平低于对照组(P＜0.05)。实验组DVL2蛋白的表达水平在1-3天呈现下降趋势，在3-5天内呈现出上升趋势(p＜0.05);对照组DVL2蛋白的表达水平在1-3天以内呈现上升趋势，在3-5天内略微下降。
　　(6).实验组的磷酸化的DVL2蛋白的表达水平低于对照组（P＜0.05）。实验组磷酸化的DVL2蛋白的表达水平在1-3天呈现下降趋势，在3-5天内呈现出上升趋势(p＜0.05);对照组磷酸化的DVL2蛋白的表达水平在1-3天以内也呈现下降趋势，之后基本维持在恒定的水平。
　　结论:
　　高脂血症通过抑制DVL2基因、DVL2蛋白和磷酸化的DVL2蛋白的表达，在一定程度上干扰种植体的早期骨结合。此研究为提高高脂血症患者种植的成功率提供了理论支持。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

实验材料

1 实验仪器

2 实验试剂

3 主要溶液的配制

4 实验器材

5 实验动物

6 高脂饲料

7 种植体

实验方法

1 动物模型建立

2 种植体植入

3 取材及处理

4 微观分析

5 RT-PCR检测DVL2的mRNA表达

6 Western Blot检测DVL2蛋白的表达

7 Western Blot检测磷酸化的DVL2蛋白的表达

8 统计分析

结果

1 大鼠血脂检测结果

2 光学显微镜微观形态动态分析

3 SEM微观形态动态分析

4 EDS微观成分动态分析

5 RT-PCR检测DVL2的mRNA表达

6 Western blot检测DVL2蛋白的表达

7 Western blot检测磷酸化的DVL2蛋白的表达

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表文章