稀土氧化钕致大鼠肺损伤作用机制的实验研究

摘要

研究目的：
　　为探究稀土氧化钕的肺损伤作用及机制，为接触人群的安全暴露和作业场所职业接触限值的制定提供科学依据，我们进行了本实验研究。
　　研究方法：
　　1.将SD大鼠按体重随机分为氧化钕染尘组（100mg/kg）和对照组，采用非暴露式气管内灌注法一次性进行染毒。分别在染毒后的第3d、7d、14d、21d、28d五个时间点处死大鼠。
　　2.收集大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)，分析BALF中细胞成分，测定BALF中总蛋白含量，采用酶联免疫法（ELISA法）测定BALF中MCP-1、MIP-1α、ICAM-1、IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。
　　3.收集大鼠肺组织标本，取部分标本采用HE染色法，染色后通过普通光镜下观察肺组织病理学改变;同时取部分标本进行天狼猩红染色，染色后用Nikon Eclipse E800偏振光显微镜及Image-Pro Plus Version4.5forwindowsTM图象分析系统分析大鼠肺组织中胶原纤维变化情况。
　　4.提取大鼠肺组织蛋白，采用Western blotting法及非放射性凝胶迁移实验EMSA(EMSA)法测定大鼠肺组织中NF-κB p65、p-NFκB p65、p-IKK beta及NF-κB的表达。
　　5.培养NR8383细胞，采用MTT法测定稀土氧化钕对细胞的毒性作用;采用透射电镜法及流式细胞法观察细胞超微结构变化及凋亡情况;采用酶联免疫法（ELISA法）测定细胞培养液上清中MCP-1、MIP-1α、TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-8的含量。
　　6.提取染毒后细胞蛋白，Western blotting法测定细胞中p-NFκB p65、p-IκKβ和Caspase-3的表达
　　研究结果：
　　1.实验大鼠体重及肺脏器系数变化
　　大鼠染毒后第3、7、14、21和28d体重均低于对照组大鼠体重，差异有统计学意义(P＜0.05)，而大鼠肺脏器系数均高于对照组(P＜0.05)，提示可能是氧化钕粉尘致大鼠肺组织发生炎症反应致充血、水肿或组织增生。
　　2.染尘大鼠肺组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原面积百分比变化情况
　　与对照组比较，染尘组大鼠各观察点肺组织Ⅰ型胶原面积百分比均有不同程度的增加，第7天、第14天、第21天和第28天时差异具有统计学意义(P＜0.05)。随着染尘时间的延长，Ⅰ型胶原面积百分比逐渐增加。第28d时，Ⅰ型胶原面积百分比增加了1倍。
　　3.染尘大鼠BALF中细胞因子水平的测定
　　与对照组相比，氧化钕染尘组大鼠BALF中IL-1和TNF-α的表达水平显著增加(P＜0.05)，染尘组大鼠BALF中IL-6表达水平增加，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　与对照组相比，氧化钕染尘组大鼠BALF中炎症趋化因子(MCP-1，MIP-1α和ICAM-1)的表达水平呈增高趋势。MCP-1和MIP-1α仅在第28天时表达水平显著增加(P＜0.05)。
　　4.染尘组大鼠NF-κB相关蛋白表达情况
　　氧化钕染尘组，大鼠肺组织内p-NF-κB P65蛋白表达量的增加，而大鼠肺组织内NF-κB P65总蛋白水平并没有发生变化;在染尘第14天，大鼠肺组织内p-IKKβ及p-NF-κ B P65的表达水平达到高峰，到第28天呈现下降趋势。对照组中大鼠肺组织内p-NF-κB P65，NF-κB P65和p-IKKβ的表达未观察到变化。氧化钕染尘组，大鼠肺组织N F-κB P50/P65的核转位被诱导，与蛋白印迹法测定的结果相一致。更重要的是，大鼠肺组织内NF-κB P50/P65的迁移在第3天增加，第14天达高峰，在第21天开始下降。
　　5.稀土氧化钕颗粒物对NR8383细胞的毒性作用
　　NR8383细胞经稀土氧化钕颗粒物混悬液处理12h、24h、48h后，1.56、3.125、6.25μg/mL染毒组在各时间点的细胞抑制率与对照组相比，差异均无统计学意义(p＞0.05);随着稀土氧化钕颗粒物浓度的增加，细胞抑制率呈现上升趋势（R2值分别为0.959、0.948、0.943）;在染毒浓度为50、100、200μg/mL时，不同染毒时间点的细胞抑制率差异均有统计学意义(F=9.54，P＜0.05; F=17.596，P＜0.05; F=9.332，P＜0.05);稀土氧化钕颗粒物作用于NR8383细胞，细胞毒性呈现剂量-效应关系和时间-效应关系。
　　6.不同浓度稀土氧化钕颗粒物暴露对NR8383细胞凋亡的影响
　　NR8383细胞经不同浓度稀土氧化钕颗粒物混悬液处理24h后，各染毒组早期凋亡细胞百分比呈现不同程度的增加，6.25、12.5μg/mL染毒组早期凋亡细胞百分比与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，12.5μg/mL染毒组早期凋亡细胞百分比是对照组的7.2倍。在0μg/ml～25μg/mL浓度范围内，随着染毒浓度的增加，晚期凋亡细胞百分比(1.8％、2.4％、2.6％、3.8％、4.1％)逐渐增加，12.5、25、50μg/mL染毒组晚期凋亡细胞百分比与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。至50μg/mL时，凋亡细胞百分比开始下降。
　　7.不同浓度稀土氧化钕颗粒物刺激对NR8383细胞上清中IL-1β、 TNF-α、 IL-8、MCP-1、MIP-1α、 TGF-β1分泌的影响
　　稀土氧化钕颗粒物刺激NR8383细胞24h后，染毒组NR8383细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均高于阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，且染毒组细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量随着染毒剂量的增加呈现增高趋势(R2值分别为0.986、0.923、0.922、0.990、0.985、0.984)，不同染毒组之间两两比较差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　8.细胞毒性与细胞因子之间的相关性分析
　　稀土氧化钕颗粒物刺激NR8383细胞24h后，细胞抑制率与上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相关(P＜0.01);且TGF-β1、 MIP-1α、MCP-1、TNF-α、IL-1β及IL-8的含量与细胞抑制率之间的相关系数分别0.912、0.932、0.933、0.935、0.943、0.962。
　　9.NR8383细胞中Caspase-3、p-NF-κB p65和p-IκKβ的表达
　　NR8383细胞给予稀土氧化钕颗粒物刺激24h后，各染毒组细胞表达p-NFκBp65、p-IκKβ的量均高于对照组，且浓度为12.5、25、50ug/mL时差异具有统计学意义（P＜0.05）;各染毒组细胞Caspase-3的表达量均高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　10.细胞因子与NF-κB相关蛋白之间的相关性分析
　　稀土氧化钕颗粒物刺激NR8383细胞24h后，NF-κB相关蛋白(p-NF-κBP65、p-IKKβ)与上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相关;IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量与p-NF-κBP65之间的相关系数分别为0.484、0.359、0.539、0.527、0.535、0.598;;IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量与p-IKKβ之间的相关系数分别为0.326、0.299、0.406、0.397、0.407、0.391。
　　11.细胞因子与Caspase-3之间的相关性分析
　　稀土氧化钕颗粒物刺激NR8383细胞24h后， Caspase-3与上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相关，IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量与Caspase-3之间的相关系数分别为0.177、0.121、0.300、0.258、0.300、0.277。
　　结论：
　　(1)稀土Nd2O3颗粒物通过非气管暴露的方式进入大鼠肺组织，可致大鼠发生急性肺组织损伤，早期表现以炎性损伤为主，晚期可形成纤维细胞性结节。
　　(2)在稀土氧化钕颗粒物致大鼠急性肺损伤过程中，促炎和抗炎细胞因子以及蛋白表达显著增加，NF-κB由细胞浆向细胞核转移并活化，NF-κB炎性通路被激活，说明NF-κB在稀土氧化钕颗粒物导致肺损伤过程中具有重要作用。
　　(3)培养液上清中的炎性细胞因子及趋化因子的含量显著升高，肺泡巨噬细胞的p-NF-κBP65、p-IKKβ蛋白表达显著升高，NF-κB信号通路激活。
　　(4)肺泡巨噬细胞的凋亡程度随着炎性细胞因子和趋化因子及Caspase-3表达水平的升高而升高，炎性细胞因子与Caspase-3呈正相关，TNF-α/TNFR/NF-κ B信号通路对肺泡巨噬细胞的凋亡可能具有促进作用。
　　(5)细胞分泌的炎性细胞因子水平、p-NF-κBP65、p-IKKβ蛋白的表达水平、肺泡巨噬细胞的凋亡水平以及其相互作用关系，说明NF-κB信号通路激活、肺泡巨噬细胞凋亡启动是稀土氧化钕颗粒物致肺损伤的重要机制。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 综述

第二章 NF-κ B信号通路在氧化钕所致大鼠肺急性损伤中的调控作用

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三章 稀土氧化钕颗粒物致大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)损伤过程中的机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4．结论

参考文献

致谢

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