纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶用于肿瘤放化疗的研究

摘要

肿瘤严重威胁着人类健康，将放疗和化疗联合应用的放化疗治疗是临床常用的肿瘤综合治疗策略之一。近年来，研究新型放化疗治疗策略以提高肿瘤放化疗治疗效果是肿瘤治疗的研究热点。其中，新型放射增敏剂的研究为研究新型放化疗治疗策略提供了新契机。
　　在诸多新型放射增敏剂中，纳米金因其独特优势脱颖而出。纳米金作为新型放射增敏剂，具有生物相容性良好、反应惰性、合成路线简单和表面易修饰等优势。基于肿瘤综合治疗的理念，将纳米金这一新型放射增敏剂与化疗药物联用，作为新型放化疗治疗策略成为目前的研究焦点。
　　盐酸多柔比星(Doxorubicin，DOX)是一种广谱抗肿瘤药物，临床可用于急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等肿瘤的治疗。作为蒽环类拓扑异构酶-Ⅱ抑制剂，DOX可嵌合于DNA双螺旋结构中，阻止DNA复制，干扰mRNA转录，最终抑制蛋白表达。DOX抗肿瘤作用机制明确，临床应用广泛，因此本课题以DOX作为模型化疗药物，将其与新型放射增敏剂纳米金联用，探究该联用策略对肿瘤放化疗治疗的增强效果。
　　近年来，将DOX用于黑色素瘤的研究取得了一定成果。黑色素瘤是死亡率最高的皮肤癌之一，其初始症状不明显，患者确诊时肿瘤细胞往往已侵袭至皮肤深层。在对侵袭较深的黑色素瘤临床治疗策略中，放化疗占据重要地位，因而对增强黑色素瘤放化疗治疗效果的探究越来越受到研究学者的重视。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)发布的黑色素瘤治疗指南指出，瘤内给药是临床治疗黑色素瘤的重要给药途径之一。瘤内给药具有提高瘤内药物分布，增强肿瘤治疗效果等优势。因此，采用瘤内给药方式，探究新型治疗策略用于增强黑色素瘤放化疗效果，具有科学研究价值和临床应用潜力。
　　近年来，温敏凝胶作为瘤内给药剂型受到广泛关注。温敏凝胶作为瘤内给药剂型具有以下优势:在室温或低温时呈液体状态，方便给药;在体温时呈凝胶状态，可缓慢释放药物，延长药物局部滞留时间。普朗尼克F127(Pluronic(@)F127,F127)是一种常见的嵌段共聚物温敏凝胶基质。作为FDA批准的药用辅料，F127用作温敏凝胶基质具有安全性高，价格低廉和生物相容性好等优势。因此，对F127温敏凝胶制剂的研究具有重要科学意义。
　　为提高肿瘤放化疗效果，本课题提出创新性联用策略:将新型放射增敏剂纳米金和DOX联合用于肿瘤放化疗。为实现黑色素瘤的瘤内给药，延长纳米金和DOX在黑色素瘤内的滞留时间，本课题构建了基于F127的温敏凝胶制剂并共载纳米金和DOX，通过瘤内注射方式给药，最终增强对黑色素瘤的放化疗治疗效果。本课题主要研究方法和结果如下:
　　1.采用柠檬酸钠还原氯金酸，成功合成了纳米金，并对其表面进行了PEG修饰，所得PEG修饰纳米金(AuNPs)在524nm波长处有最大吸收。采用紫外分光光度计，建立了DOX在pH6.8和pH7.4条件下体外含量测定方法，DOX浓度在0.5～100μg/mL范围内符合测定要求。
　　2.采用冷溶法制备了空白、单载和双载温敏凝胶制剂。以胶凝温度、胶凝时间和通针性为指标对处方进行了优化，确定了最优处方:浓度为22％的F127,分别含DOX0.5 mg/mL和AuNPs1 mg/mL，胶凝温度为27.2±0.3℃，胶凝时间为170±9s，在20℃及以下时通针性良好。对AuNPs溶液和双载温敏凝胶制剂的微观形态、粒径和zeta电位进行了考察和比较，结果显示AuNPs溶液和双载温敏凝胶制剂中纳米金微观形态均匀圆整，粒径大小为13.09±1.77 nm，AuNPs溶液zeta电位为-13.5±2.93 mV，双载制剂zeta电位为-14.9±2.20 mV。采用椎板法对双载温敏凝胶制剂流变学性质进行了考察，在剪切速率恒定时，温敏凝胶制剂的粘度在10℃至27.5℃之间随温度升高而逐渐增大，在27.5℃之后粘度趋于稳定状态，表明了AuNPs和DOX双载温敏凝胶制剂的温度敏感性;在制剂处于体温37℃时，其剪切应力均随剪切速率的增加而增大，其粘度均随剪切速率的增加而减小，表明AuNPs和DOX双载温敏凝胶处于凝胶状态时表现为假塑性流体。采用动态膜透析法测定了DOX的体外释放行为，水溶液对照组的DOX累积释放在8h时达到顶峰，高于凝胶制剂组在8h时的累积释放(p＜0.05)，验证了双载温敏凝胶制剂对DOX的缓释。
　　3.采用MTT法测定了AuNPs和DOX在肝癌细胞HepG2和黑色素瘤细胞B16上的细胞毒性和IC50值。本课题所用AuNPs浓度范围内细胞存活率均大于80％，表明AuNPs浓度在1～20 nM时细胞安全性良好;DOX在HepG2和B16细胞上的IC50值分别为4.20±0.66和0.21±0.05μM。采用ICP-AES对HepG2和B16细胞的AuNPs摄取进行了测定。HepG2细胞对纳米金摄取量达峰时间为36h，与24 h时摄取量无统计学差异(p＞0.05);B16细胞对纳米金摄取量达峰时间为24 h。因此，设定AuNPs孵育后24 h给予X射线照射。分别采用MTT法和克隆形成试验验证了在6 MvX射线照射下AuNPs对HepG2和B16细胞的射线增敏作用，考察了AuNPs与DOX联用对HepG2和B16细胞杀伤的增强作用，结果表明:AuNPs存在时，X射线对HepG2和B16细胞的杀伤作用大于射线对照组(p＜0.05)，验证了AuNPs的X射线增敏作用;AuNPs和DOX联用组比单独用药组对HepG2和B16细胞的杀伤作用更强(p＜0.05)，验证了联用的优越性。
　　4.分别采用抑瘤试验和组织切片Ki-67染色验证了AuNPs在小鼠黑色素瘤模型中对6MvX射线的增敏作用及其与DOX联用优势。结果表明:AuNPs在无X射线照射下与生理盐水组肿瘤体积变化类似(p＞0.05)，说明AuNPs自身无抗肿瘤活性;在X射线照射下AuNPs组肿瘤体积小于射线照射组(p＜0.05)，验证了AuNPs的X射线增敏效果;在X射线照射下AuNPs和DOX双载制剂的肿瘤体积显著小于单载制剂组(p＜0.01)，验证了双载制剂对B16荷瘤小鼠的抑瘤效果优于单载制剂;在X射线照射下AuNPs和DOX双载制剂的肿瘤体积显著小于混合溶液组(p＜0.01)，验证了温敏凝胶制剂对B16荷瘤小鼠的抑瘤效果优于混合溶液组。分别测定了DOX和AuNPs的瘤内滞留量，考察了小鼠肿瘤内DOX和金元素(Au)的滞留效应。结果显示:在所测时间点内，水溶液组DOX瘤内滞留率显著低于温敏凝胶组(p＜0.01)，水溶液组给药后8h瘤内DOX滞留率降为33.7±4.6％，温敏凝胶组给药后24 h和48h瘤内滞留率分别为58.7±6.6％和15.7±2.1％;温敏凝胶组和溶液组给药后48 h两者的AuNPs瘤内滞留率分别为35.8±3.42％和14.2±3.43％。说明了双载温敏凝胶制剂相比于水溶液制剂对DOX和AuNPs瘤内滞留具有延长效果。通过测定小鼠体重变化，单载AuNPs温敏凝胶的大鼠皮肤急性刺激性试验和小鼠主要器官组织切片H&E染色评价了本课题所制备制剂对小鼠体重、大鼠背部皮肤和小鼠主要组织器官的损伤，结果显示三项试验中均未观察到明显损伤迹象，验证了本课题所制备制剂对小鼠体重、大鼠背部皮肤和小鼠主要组织器官无明显损伤作用。
　　综上所述，本课题合成了纳米金并完成了PEG对其表面的修饰，构建了共载AuNPs和DOX的F127温敏凝胶制剂。本课题所制备共载AuNPs和DOX的温敏凝胶制剂具有温度敏感性，制剂中DOX的体外释放具有缓释性，制剂中AuNPs和DOX的瘤内滞留时间均得到延长，在小鼠黑色素瘤模型上对黑色素瘤放化疗治疗效果有增强作用。本课题将新型放射增敏剂纳米金和DOX共载于F127温敏凝胶制剂中，通过瘤内给药，增强了对黑色素瘤的放化疗治疗效果，为临床实现放射增敏剂和化疗药物共递送提供了新的设计理念和研究基础;本课题提出了将新型放射增敏剂纳米金和DOX联用策略，在肝癌细胞HepG2和黑色素瘤细胞B16上验证了该联用策略的优越性，为临床联合用药策略提供了新思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、肿瘤放化疗的研究进展

1．肿瘤化学治疗简述

2．肿瘤放射治疗简述

3．肿瘤放化疗简述

二、放射增敏剂和化疗药物共递送的研究进展

1．放射增敏剂的临床应用及纳米金用于放射增敏的研究现状

2．纳米金与化疗药物共递送在肿瘤治疗中的研究

3．放射增敏剂与化疗药物共递送的剂型选择

三、课题设计

第一章 纳米金的合成和盐酸多柔比星在释放介质中含量测定的方法学考察

一、试验材料

1．主要试剂

2．主要仪器

3．试剂配制

二、试验方法和结果

1．纳米金的合成及修饰

2．盐酸多柔比星含量测定方法的建立

三、讨论

四、本章小结

第二章 纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶的制备及理化性质评价

一、试验材料

1．主要试剂

2．主要仪器

3．试剂配制

二、试验方法和结果

1．纳米金的合成及修饰

2．纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶的处方优化

3．纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶的表征

4．纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶的体外药物释放

三、讨论

四、本章小结

第三章 纳米金和盐酸多柔比星联用的体外放化疗效果评价

一、试验材料

1．主要试剂

2．主要仪器

3．试剂配制

4．细胞培养

二、试验方法和结果

1．细胞毒性评价

2．纳米金放射增敏评价及其与盐酸多柔比星联用的放化疗效果评价

三、讨论

四、本章小结

第四章 纳米金和盐酸多柔比星双载温敏凝胶的体内放化疗评价

一、试验材料

1．主要试剂

2．主要仪器

3．试剂配制

4．动物试验

二、试验方法和结果

1．小鼠肿瘤抑制试验

2．肿瘤组织中盐酸多柔比星含量测定方法建立

3．盐酸多柔比星和纳米金瘤内滞留时间

4．皮肤刺激性试验

三、讨论

四、本章小结

全文总结

一、全文结论

二、创新点

三、展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文