拟南芥糖基转移酶基因UGT72B1调节细胞壁木质化的功能研究

摘要

细胞的木质化主要是木质素在细胞壁内沉淀的过程。正常情况下，该过程主要发生于维管束的次生木质部，进而增加木质部细胞壁硬度和机械支撑力。木质素的累积还能增强植物体长距离水分运输能力以及抵御机械损伤和病原菌微生物的侵害等。细胞木质化的生理学过程既是一个代谢问题，又是一个发育问题。由于调节细胞木质化的基因数量众多，机制复杂，目前了解很少。因此，深入研究细胞木质化的调控机理，不仅对于理解植物生长发育的规律有重要的科学理论意义，而且对于农作物改良以及树木材质改良具有潜在的应用价值。
　　植物体内普遍存在木质素单体的糖基化修饰现象，然而该现象从上个世纪六七十年代发现以来，一直没有研究清楚木质素单体糖基化是否与木质素合成之间存在关系。为了深入理解它们之间的关系以及探索糖基化修饰在木质素代谢以及细胞木质化过程中的作用机制，我们围绕糖基转移酶UGT72B1开展了一系列的研究工作，取得了重要进展。
　　1.ugt72b1突变体鉴定与表型分析
　　本研究首先筛选鉴定出了UGT72B1两个拟南芥T-DNA插入突变体ugt72b1ko-1（SALK_049597）和ugt72b1ko-2（SAIL_611_E04）的纯合株系，发现它们有相同的表型:一方面茎尖有大量花青素积累，另一方面茎尖生长受到严重抑制。将UGT72B1基因导入到突变体后表型能完全恢复到野生型状态，说明突变体表型确实是由UGT72B1功能缺失导致。我们对茎段横切面进行木质素特异性染色，不论是Wiesner染色还是M(a)ule染色，结果都表明突变体出现了严重的异位木质化和细胞壁木质化的增强。木质素含量分析表明突变体的木质素含量比野生型显著增加。透射电镜观察细胞壁厚度发现突变体细胞壁厚度明显增厚。以上结果表明UGT72B1参与了细胞壁的木质化过程，它的功能缺失会导致细胞壁异位木质化和增强的木质化，并影响植物的生长发育。
　　2.UGT72B1底物筛选及生化分析鉴定
　　构建了UGT72B1的原核表达载体，经表达和纯化获得了重组蛋白，利用体外酶促反应并借助HPLC-MS技术，我们对激素类物质如生长素和赤霉素等以及苯丙烷类物质如木质素前体和黄酮类物质等进行了筛选，鉴定出这个糖基转移酶能够糖基化松柏醇、二氢松柏醇、对羟基肉桂醇和松柏醛等木质素前体。同时我们检测UGT72B1高表达体内松柏苷含量，发现明显高于野生型和恢复系。对UGT72B1酶促动力学常数测定，发现UGT72B1对松柏醇的活性最高，比酶活为6.6 nkat/mg，Kcat/Km为0.74 mM1s-1，高于对松柏醛的催化效率（3.1 nkat/mg和0.30 mM-1s-1）。同时我们也对UGT72B1的同源基因UGT72B2和UGT72B3进行了原核表达的蛋白纯化和底物筛选，发现UGT72B3能够糖基化芥子醛和松柏醛，但没有发现UGT72B2对木质素前体的酶活性。将UGT72B2和UGT72B3在ugt72b1突变体内组成型过表达，发现UGT72B3能够恢复ugt72b1的表型，而UGT72B2不能恢复。以上结果表明UGT72B1能够糖基化木质素前体。同时也表明UGT72B1与UGT72B3在生化活性上有一定的相似性。
　　3.基因的表达模式分析
　　构建了UGT72B1启动子驱动的GUS基因表达系统，对GUS活性的组织化学染色表明:幼苗期，UGT72B1在茎生长点及新生叶叶脉的连接处有较强表达;抽薹以后，主要在幼嫩茎尖、幼嫩茎生叶的叶脉、花序柄以及花瓣的维管组织中表达。从茎的横切面染色来看，UGT72B1在幼嫩茎的各个组织都有表达，如木质部、髓部和表皮，但是在稍微老点的茎中只在木质部表达。另外通过qRT-PCR也对表达模式进行了分析，结果显示UGT72B1在各个组织的表达模式与GUS组织化学染色结果基本一致，其中主要在幼嫩的茎中表达。同时利用GUS染色和qRT-PCR技术分析了UGT72B2、UGT72B3与UGT72E2基因的表达模式，发现UGT72B2主要在叶片的叶脉上表达;UGT72B3主要在叶柄的基部有较强表达，在幼嫩叶片叶边缘的出水孔处有很强的表达，导管处也有微量表达。UGT72E2主要在苗期表达，在根和茎中只有少量表达。检测了ugt72b1突变体背景下UGT72B3与UGT72E2的表达量变化，发现二者的表达量都有所提高。以上结果表明UGT72B1表达部位正好与突变体产生表型的部位向吻合。几个进化关系很近的糖基转移酶表达模式各不相同，都有自己的表达部位偏好性，可能与它们发挥的主要作用相关。
　　4.突变体转录组及qRT-PCR分析
　　qRT-PCR检测木质素合成相关基因（包括前体合成、前体运输、前体聚合和相关转录因子）在突变体中的表达情况，发现木质素前体合成相关基因CCR、COMT、HCT、CAD、4CL、C4H、CCOATOT和PAL都有明显的上调表达;前体运输及聚合相关基因ABCG、RBOH、PRX和LAC上调表达也比较明显;木质素合成相关转录因子基因MYB58、MYB61、MYB63和MYB643以及NAC家族成员NST1和NST3表达量也显著上调。另外我们还检测到花青素合成通路中的DFR及黄酮合成通路中的CHS上调表达比较显著。这些结果说明在突变体中涉及木质素单体以及木质素合成的整个代谢都获得了增强。为了更加全面了解转录组的变化，对突变体进行了转录组分析。结果发现突变体中共有931个基因的表达发生了显著变化，其中有705个上调显著，226个下调显著。差异表达的基因主要集中在苯丙烷代谢途径、黄酮合成途径、植物病原体互作途径、淀粉和糖代谢途径、以及苯丙氨酸代谢途径。但是只有苯丙烷-木质素代谢途径中几乎每一步的基因都显示上调表达，这与qRT-PCR分析的结果是一致的。以上结果表明突变体中UGT72B1的功能缺失激活了苯丙烷-木质素合成途径上的相关基因，甚至苯丙烷代谢分支途径里的基因也被激活，结果导致细胞壁严重的异位木质化和木质化程度的增强，并且伴有花青素积累和茎生长发育受阻。
　　总之，本论文的结果不仅增加了对植物糖基转移酶家族的功能理解，而且首次证明木质素单体的糖基化修饰参与调节细胞壁木质素的合成过程，回答了近半个世纪以来悬而未决的科学问题，为研究糖基化修饰在木质素代谢以及细胞木质化过程中的作用机制提供了重要的突破口，为深入而且全面理解木质素合成以及细胞壁木质化的分子机制奠定了新的理论基础。

目录

声明

摘要

符号说明及缩略词

第一章 文献综述

1．1 植物木质素合成途径及其基因调控研究进展

1．1．1 木质素前体的合成

1．1．2 木质素前体的运输

1．1．3 木质素单体的聚合

1．1．4 木质素合成调控

1．2 苯丙烷次生代谢的糖基化研究进展

1．2．1 糖基转移酶简述

1．2．2 苯丙烷代谢物的糖基化

1．3 木质素前体的糖基化与木质素合成

1．3．1 木质素单体糖基化的普遍存在以及可能意义

1．3．2 糖苷酶与木质素合成关系研究

1．3．3 糖基转移酶与木质素合成关系研究

1．4 立题意义及研究内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 实验试剂与仪器

2．1．4 常用培养基配制

2．1．5 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 植物DNA提取

2．2．2 植物RNA的提取与反转录

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 Real-time PCR扩增反应

2．2．5 克隆基因片断的纯化回收

2．2．6 克隆基因的连接

2．2．7 大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒转化、质粒提取和酶切验证

2．2．8 农杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．9 原核表达载体pGEX3H-UGT的构建及转化

2．2．10 GST融合蛋白的表达纯化

2．2．11 酶促反应条件

2．2．12 HPLC以及LC-MS分析条件

2．2．13 标准曲线的绘制

2．2．14 各基因启动子克隆与GUS报告载体构建

2．2．15 植物表达载体构建

2．2．16 拟南芥转化及转基因植株的筛选

2．2．17 GUS染色分析

2．2．18 石蜡切片

2．2．19 透射电镜

2．2．20 扫描电镜

2．2．21 木质素H、G和S型组分含量测定

2．2．22 木质素染色观察

2．2．23 植物体内木质素单体糖苷的提取以及其后HPLC分析条件

2．2．24 花粉管染色

2．2．25 花粉粒体外萌发

2．2．26 花青苷和黄酮提取

2．2．27 转录组测序

第三章 结果与分析

3．1 ugt72b1突变体鉴定与表型分析

3．2 UGT72B1功能恢复系的构建与表型分析

3．2．1 UGT72B1功能恢复系的植物表达载体构建

3．2．2 UGT72B1功能恢复系纯合株系的筛选

3．2．3 功能恢复株系表型分析

3．3 ugt72b1突变体茎中细胞壁木质化出现异常

3．4 ugt72b1突变体茎中细胞璧加厚

3．5 ugt72b1突变体茎中木质素含量变化

3．6 原核表达载体构建

3．6．1 克隆载体的构建

3．6．2 原核表达载体构建

3．7 酶蛋白的原核表达与纯化

3．8 体外酶活性鉴定

3．8．1 纯化的UGT72B1融合蛋白与松柏醇的反应

3．8．2 纯化的UGT72B1融合蛋白与松柏醛的反应

3．8．3 纯化的UGT72B1融合蛋白与二氢松柏醇的反应

3．8．4 纯化的UGT72B1融合蛋白与对羟基肉桂醇的反应

3．8．5 纯化的UGT72B1融合蛋白与对羟基肉桂醛的反应

3．8．6 纯化的UGT72B1融合蛋白与其它苯丙烷代谢中间产物以及激素的反应

3．8．7 纯化的UGT72B3融合蛋白与芥子醛的反应

3．8．8 纯化的UGT72B3融合蛋白与松柏醛的反应

3．8．9 纯化的UGT72B3融合蛋白与其它苯丙烷代谢中间产物的反应

3．8．10 UGT72B2融合蛋白酶活检测

3．9 糖基转移酶动力学常数分析

3．9．1 比酶活分析

3．9．2 动力学常数分析

3．10 拟南芥UGT72B1基因的表达特异性研究

3．10．1 GUS染色分析

3．10．2 拟南芥各组织中UGT72B1表达的实时定量PCR分析

3．11 突变体中木质素合成相关基因的表达分析

3．11．1 前体合成相关基因的表达分析

3．11．2 前体运输及聚台相关基因的表达分析

3．11．3 木质素合成相关转录因于的表达分析

3．12 ugt72b1突变体转录组数据分析

3．12．1 转录组测序质量概况

3．12．2 差异表达基因筛选

3．12．3 差异表达基因的GO分类及KEGG富集分析

3．13 ugt72b1突变体及过表达体内源松柏苷含量分析

3．13．1 UGT72B1过表达体构建

3．13．2 UGT72B1过表达株系筛选

3．13．3 糖苷含量测定

3．14 UGT72B2、UGT72B3对ugt72b1表型的恢复

3．14．1 UGT72B2、UGT72B3过表达载体的构建

3．14．2 ugt72b1背景下UGT72B2和UGT72B3过表达株系的获得与表型分析

3．15 拟南芥UGT72B2-UGT72B3与UGT72E2基因的表达特异性研究

3．15．1 载体构建及株系筛选

3．15．2 GUS染色分析

3．15．3 拟南芥各组织中UGT72B3与UGT72E2实时定量PCR分析

3．16 UGT72B3与UGT72E2在ugt72b1突变体中的表达分析

3．17 ugt72b1其它表型分析

3．17．1 花青素与黄酮糖苷的积累

3．17．2 育性的降低

第四章 讨论

4．1 UGT72B1在木质素合成过程中的作用

4．2 72B家族和72E家族成员在木质素合成过程中的关系

4．3 UGT72B1的底物多样性

4．4 木质素合成中可能存在着与糖基化修饰有关的反馈调节机制

总结及本论文创新点

参考文献

在学期间发表论文

致谢

附表