血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞修复脂多糖诱导大鼠心肺损伤的研究

摘要

本研究以脐带间充质干细胞(UC-MSCs)作为载体，利用基因转染技术使其携带并高表达血管生成素1（Ang1）基因，增强UC-MSCs的作用。应用UC-MSCs-Ang1植入大鼠急性肺损伤（ALI）模型后，观察UC-MSCs与UC-MSCs-Ang1对ALI大鼠的抗炎修复作用、减轻肺水肿及炎性细胞浸润、促进干细胞在肺组织的存活，提高ALI大鼠的存活率;研究UC-MSCs-Ang1抑制LPS诱导的心肌损伤炎症反应与心肌细胞凋亡、改善心肌损伤后心脏结构与功能的影响，为脓毒血症急性心肺损伤的细胞及基因治疗提供新的理论依据。
　　目的：
　　1.人UC-MSCs分离、培养与鉴定;构建携带GFP和Ang1基因的慢病毒载体后转染UC-MSCs，并检测Ang1在转染UC-MSCs中的表达情况。
　　2.建立UC-MSCs-Ang1治疗LPS诱导的大鼠ALI实验方法;观察Ang1基因转染后促进UC-MSCs对LPS所致肺损伤、肺水肿、全身炎症反应、细胞植入率、生存率等的改善作用。
　　3.观察UC-MSCs-Ang1抑制LPS诱导的心肌损伤炎症反应与心肌细胞凋亡;研究UC-MSCs-Ang1对LPS诱导心肌损伤后心脏结构与功能的影响，为其在心血管疾病中的应用提供理论依据。
　　方法：
　　一、人脐带间充质干细胞的生物学特性及Ang1基因修饰UC-MSCs的获得
　　1.UC-MSCs的分离、培养、扩增
　　2.UC-MSCs的形态及免疫表型检测
　　3.UC-MSCs诱导分化能力的鉴定
　　4.Ang1基因的获取与克隆
　　5.含有Ang1基因的慢病毒包装、收获及转染效率的测定
　　6.携带GFP和Ang1基因的慢病毒感染UC-MSCs后，荧光显微镜观察荧光表达;转染72小时后流式细胞学检测MSCs中GFP表达、Western-Blot检测MSCs中Ang1蛋白表达。
　　7.统计学分析:所有数据用SPSS17.0统计软件进行分析。
　　二、血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤
　　1.LPS诱导大鼠急性肺损伤模型的建立与分组
　　2.分别于造模后6h、24h、48h、8d、15d每组处死3-5只大鼠，收集血清、肺组织，进行常规病理切片、支气管肺泡灌洗液等标本。
　　3.检测肺组织湿干重比、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞计数及肺组织髓过氧化物酶活性的检测、HE染色观察肺组织的病理改变及肺损伤严重程度病理评分。
　　4.ELISA法检测血清中TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-10的蛋白含量。
　　5.MSCs-Ang1在损伤肺组织的迁徙和植入的检测
　　6.生存分析
　　7.统计学分析
　　三、血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞改善脂多糖诱导的大鼠左室心肌重塑与功能
　　1.心电图
　　2.超声心动图
　　3.Millar导管检测心功能参数
　　4.血清学指标检测
　　5.病理学检测心肌
　　6.实时定量RT-PCR基因水平检测
　　7.Western Blot检测
　　8.统计学分析
　　结果：
　　一、人脐带间充质干细胞的生物学特性及Ang1基因修饰UC-MSCs的获得
　　1.培养、鉴定MSCs
　　2.诱导分化及鉴定
　　3.慢病毒表达载体的收获及转染效率
　　4.收获Ang1基因修饰的UC-MSCs
　　二、Ang1修饰人UC-MSCs减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤
　　1.ALI后肺组织病理学变化及肺损伤评分
　　腹腔注射LPS6h后，肺组织病理HE染色表现为明显的毛细血管扩张充血，中性粒细胞明显增多、渗出，并于48h达到高峰，同时出现一些小的脓肿及肺大疱。
　　2.支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数量及肺组织MPO活性
　　于24h和48h MSCs-Ang1组与MSCs组相比，支气管肺泡灌洗液中性粒细胞的数量显著减少，在第8d、15d MSCs-Ang1组的中性粒细胞数接近正常对照组。
　　3.肺组织湿干重比
　　LPS组肺组织湿干重比升高(P＜0.05)，在ALI造模48h、8d，MSCs-Ang1组与MSCs相比肺组织湿干比明显降低(P＜0.01-0.05)。
　　4.ELLISA检测细胞因子
　　促炎介质TNF-α、IL-6、TGF-β1的血清浓度的升高，证实了LPS造成了显著的急性全身性炎症反应。
　　5.MSCs-Ang1在损伤肺组织的迁徙和植入的检测
　　荧光显微镜观察移植后第8d，GFP+细胞在MSCs-Ang1组肺组织切片中阳性率大于MSCs组。
　　6.生存分析
　　MSCs-Ang1治疗组15d生存率明显高于单纯MSCs组，分别为70％和50％(P＜0.05)。
　　三、Ang1修饰人脐带间充质干细胞改善脂多糖诱导的大鼠左室心肌重塑
　　1.心电图
　　LPS组部分心电图异常表现，可见QRS波形电交替、心动过速、心动过缓等各种复杂心律失常;MSCs与MSCs-Ang1干预后，未见明显复杂心律失常减少，提示MSCs-Ang1可部分改善心电活动。
　　2.超声心动图
　　左心结构的改变左心腔室大小;
　　左心收缩功能改变。
　　3.Millar导管测左心功能
　　提示MSCs-Ang1干预后对左室收缩功能显著改善。
　　4.血清学指标检测
　　心肌损伤明显好转。
　　提示虽然心肌损伤好转，但是心脏功能减低持续时间较长，且心功能不易短期较快恢复。
　　5.LPS诱导大鼠左室重塑心肌炎症、细胞凋亡及MSCs-Ang1移植的影响
　　5.1 LPS诱导后大鼠心肌炎症反应及MSCs-Ang1移植的影响
　　HE染色:与LPS组比较，MSCs与MSCs-Ang1干预后的两组，病理情况有所改善。
　　MSCs-Ang1移植影响LPS诱导大鼠心肌炎性因子TNF-α、IL-6的表达
　　免疫组织化学检测TNF-α、IL-6的表达:对照组，心肌细胞内少量、稀疏浅棕颗粒;LPS组胞浆见较多深棕颗粒，MSCs与MSCs-Ang1干预后的两组与LPS组相比，见棕色颗粒分布呈现散在且稀、疏，减少。
　　Western-Blot检测TNF-α、IL-6蛋白的表达:LPS组TNF-α、IL-6表达明显增高(P＜0.01)。经MSCs与MSCs-Ang1干预后，与LPS组比较，可见心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达呈不同程度的下降（P＜0.05）。
　　5.2 LPS诱导大鼠心肌组织细胞凋亡及MSCs-Ang1移植的影响
　　电镜观察凋亡细胞:与LPS组相比，各种病变均有所减轻，MSCs-Ang1干预较MSCs更明显改善。
　　TUNEL染色观察:LPS组左室凋亡细胞阳性率显著增加(P＜0.01)。MSCs与MSCs-Ang1干预后与LPS组相比，细胞凋亡率明显减少(P＜0.01)。
　　MSCs-Ang1移植抑制心肌细胞凋亡相关RIP3、Caspase-3表达
　　(1)凋亡相关RIP3表达
　　免疫组化染色:LPS组RIP3棕黄色阳性颗粒表达增加，且分布在细胞核周围较多，MSCs与MSCs-Ang1两组与LPS组比较，细胞内棕黄色阳性颗粒表达减少，且MSCs-Ang1注射后，棕黄色颗粒明显减少。
　　Western-Blot检测RIP3蛋白表达:LPS组表达显著增高(P＜0.01);但MSCs与MSCs-Ang1干预后，与LPS组比较，RIP3蛋白表达不同水平降低(P＜0.01-0.05)。
　　(2)凋亡相关Caspase-3表达
　　Western-Blot检测Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白比值表达:LPS组与对照组比较，比值显著增高(P＜0.01);但MSCs与MSCs-Ang1干预后，与LPS组比较，比值不同水平降低(P＜0.01-0.05)。
　　6.GFP mRNA表达外源性MSCs-Ang1细胞在心肌组织植入情况检测
　　提示Ang1能促进MSCs在损伤后的心肌组织存活与植入。
　　结论：
　　1.人脐带中可分离培养大量稳定增殖的MSCs，其细胞表型稳定，存在向成骨、脂肪细胞等多向分化能力，利用病毒转染技术，首次将携带GFP报告基因和Ang1基因的慢病毒载体高效的转染人脐带MSCs。
　　2.转染于脐带间充质干细胞的Ang1基因可通过减少中性粒细胞肺部浸润及MPO活性减轻肺水肿等明显改善LPS诱发的肺损伤、减轻LPS引起的全身炎症反应;提高了干细胞向炎性损伤肺组织的迁徙和植入。
　　3.LPS可导致大鼠心肌重塑及左心功能障碍，UC-MSCs-Ang1干预后，可抑制损伤心肌组织中炎症因子及凋亡相关基因的表达，不同程度降低血清中cTnⅠ、含量，提示抑制损伤心肌组织的炎症反应与细胞凋亡，显著降低LPS诱导大鼠的LVEDP和-dp/dt max，增加LVEF和+dp/dt max。提示改善左心室功能。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 人脐带间充质干细胞的生物学特性及血管生成素1基因修饰脐带间充质干细胞的获得

前言

实验材料和方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第二部分 血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤

前言

实验材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

第三部分 血管生成素1修饰人脐带间充质干细胞改善脂多糖诱导的大鼠左室心肌重塑与功能的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

结论

创新点与限制性

致谢

在职攻读博士学位期间科研情况

英文论著1

英文论著2