血管生成素-1对脂多糖诱导的小鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的:
　　 观察血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonarymicovascularendothelialcells，PMVEC)炎症及凋亡的影响，探讨Ang-1的抗炎和抗凋亡作用及其对PMVEC的保护机制。
　　 方法:
　　 1．新生小鼠肺微血管内皮细胞的原代培养、传代、纯化及鉴定。2．CCK8法测不同浓度的LPS（0ng/ml(对照组)、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）及Ang-1（0ng/ml(对照组)、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）作用于小鼠肺微血管内皮细胞后对其增值能力的影响，以确定最佳干预浓度。3．将分离培养的小鼠肺微血管内皮细胞随机分为7组：(A)空白对照组；(B)LPS组；(C)LPS＋Ang-1组；(D)LPS＋Ang-1＋LY294002组；(E)Ang-1组；(F)LY294002组；(G)DMSO组。4．各组细胞药物干预24小时后测定相关指标。ELISA法测各组细胞上清液中细胞因子IL-8、TNF-α的表达；流式细胞仪AnnexinV/PI法测各组细胞早期凋亡率；酶标仪检测各组细胞凋亡基因Caspase-3活性；Westernblotting法测各组细胞PI3K、P-AKT蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1．倒置显微镜下PMVEC呈典型的鹅卵石或铺路石样的形态学特征，免疫荧光法鉴定PMVEC的CD31抗原表达阳性。2．LPS终浓度为l00ng/ml时明显抑制PMVEC增殖（OD值：0.56±0.14），与对照组(OD值：1.08±0.22)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；Ang-1终浓度为l00ng/ml时明显促进PMVEC增值(OD值：1.44±0.28)，与对照组（OD值：1.07±0.24）相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。3．LPS组IL-8、TNF-α的表达、早期凋亡率、Capase-3酶活力单位分别为(780±22pg/ml、360±20pg/ml、13.00±0.58％、1.21±0.12)，与对照组(220±16pg/ml、50±14pg/ml、4.50±0.44%、0.30±0.09)比较明显增加，差异具有统计学意义（P均＜0.01）；LPS＋Ang-1组IL-8、TNF-α的表达、早期凋亡率、Capase-3酶活力单位分别为(450±17pg/ml、220±13pg/ml、6.10±0.58%、0.59±0.13）与LPS组比较明显降低，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；而Ang-1＋LPS＋LY294002组IL-8、TNF-α的表达与Ang-1＋LPS相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，但早期凋亡率(10.3±0.50%)、Caspase-3酶活力单位(0.92±0.11)与Ang-1＋LPS组比较显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。LPS组中PI3K、P-AKT蛋白表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);Ang-1＋LPS组中PI3K、P-AKT蛋白表达水平较LPS组明显上升(P＜0.05)；Ang-1＋LPS＋LY294002组与Ang-1＋LPS相比，PI3K、P-AKT蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)；此外，LY294002组与对照组相比，明显抑制了PI3K和P-AKT蛋白分子的表达(P＜0.05)；而Ang-1组与对照组相比，又明显增加了PI3K和P-AKT蛋白分子的表达(P＜0.05)；而DMSO组，对照组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 LPS作用于PMVEC可诱导其发生炎性反应及凋亡损伤，Ang-1对LPS诱导的PMVEC具有抗炎及抗凋亡的保护作用。PI3K/AKT信号转导通路可能参与了Ang-1的保护作用，PI3K/AKT信号转导通路受到抑制或阻滞时，Ang-1对LPS诱导的小鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用有所降低。Ang-1可能通过调节PI3K/AKT通路中的PI3K、P-AKT蛋白表达，进而对LPS诱导的小鼠肺微血管内皮细胞损伤产生保护性作用。

目录

声明

研究背景

1 材料与方法

一、材料

二、试验流程

三、实验方法

2 结果

1 小鼠肺微血管内皮细胞分离、培养及鉴定

2 不同浓度的药物（LPS、Ang-1）刺激对小鼠肺血管内皮细胞的增值活力的影响的研究结果

3 Ang-1对LPS诱导的PMVEC炎性反应的影响的研究结果

4 Ang-1对LPS诱导PMVEC凋亡的影响的研究结果

5 PI3K、P-AKT蛋白在Ang-1对LPS诱导PMVEC作用中的表达的研究结果

3 讨论

4 全文结论

5 参考文献

综述

缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢