骨髓间充质干细胞对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为影响的研究

摘要

增生性瘢痕(hypertrophic scar)和瘢痕疙瘩(keloid)是临床上常见的一种疾病，是皮肤真皮层在创伤愈合过程当中成纤维细胞等组织修复细胞过度增殖、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度合成为特点的纤维化疾病。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在临床表现上存在差异，增生性瘢痕通常高于皮肤表面，呈红色或粉红色，有瘙痒，发展时限通常长于正常瘢痕，通常超过1年，但不会超过原发的伤口边缘，以后渐渐萎缩，形成萎缩性瘢痕;而瘢痕疙瘩还具有侵袭性，能持续性生长，并侵入周围正常批复组织中，不能随时间而自行改善。到目前为止，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的发病机制仍不明确，因此临床上对瘢痕疙瘩与增生性瘢痕也无令人满意的治疗方法。当前的研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)可以促进皮肤创面愈合，减少瘢痕形成。然而，骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)治疗对增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSFs）和瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloidfibroblasts，KFs)的生物学行为的影响尚无明确研究。本研究以BMSCs的细胞培养基制作BMSC条件培养基，以BMSC条件培养基处理培养HSFs和KFs，并萎缩性瘢痕成纤维细胞（matured scar fibroblasts，MSFs）和正常皮肤成纤维细胞（normal skin fibroblasts，NFs）及NF条件培养基和含PBS条件培养基作为对照，观察BMSC条件培养基对HSFs和KFs在细胞增殖表型、纤维化表型和细胞外基质合成等方面的影响。
　　目的：
　　检测BMSC条件培养基处理培养，对HSFs和KFs在细胞增殖、迁移、凋亡、纤维化疾病相关基因的表达及细胞外基质合成等方面的影响，探讨BMSC旁分泌功能对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为的影响，为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的BMSC细胞治疗研究提供理论基础。
　　方法：
　　1.获取人骨髓标本，以全骨髓贴壁培养法分离培养人BMSCs，取第二代BMSCs扩增培养48h，获取BMSC细胞培养基制作BMSC条件培养基;
　　2.获取人正常皮肤、萎缩性瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩标本，胶原酶消化法分别分离培养NFs、MSFs、HSFs和KFs;
　　3.取第二代NFs扩增培养48h，获取的NF细胞培养基制作NF条件培养基;配制含PBS的条件培养基;
　　4.分别以BMSC条件培养基、NF条件培养基和含PBS的条件培养基处理培养NFs、MSFs、HSFs和KFs四类成纤维细胞一定时间，分别以CCK-8法检测细胞增殖曲线、细胞划痕法检测细胞迁移、TUNEL染色法检测凋亡;
　　5.分别以BMSC条件培养基、NF条件培养基和含PBS的条件培养基处理培养NFs、MSFs、HSFs和KFs四类成纤维细胞一定时间，分别以real-timePCR法检测纤维化疾病相关基因在mRNA水平的表达，以In-cell westernblot法和免疫荧光染色法检测纤维化疾病相关基因在蛋白水平的表达;
　　6.分别以BMSC条件培养基、NF条件培养基和含PBS的条件培养基处理培养NFs、MSFs、HSFs和KFs四类成纤维细胞一定时间，分别以real-timePCR法检测Ⅰ型胶原和纤连蛋白在mRNA水平的表达，以In-cell westernblot法和免疫荧光染色法检测Ⅰ型胶原和纤连蛋白在蛋白水平的表达;以细胞培养基中羟脯氨酸含量法检测成纤维细胞细胞外基质合成。
　　结果：
　　1.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs增殖、迁移，但不影响HSFs和KFs的凋亡;
　　2.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs表达促纤维化表型相关基因和蛋白，如CTGF、PAI-1、TGF-β1和TGF-β2;
　　3.人BMSC条件培养基促进HSFs和KFs表达抗纤维化表型相关基因和蛋白，如Decorin和TGF-β3;
　　4.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs合成细胞外基质，表现为抑制HSFs和KFs内Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达，抑制HSFs和KFs合成羟脯氨酸。
　　结论：
　　1.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs的增殖表型;
　　2.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs的纤维化表型;
　　3.人BMSC条件培养基抑制HSFs和KFs的细胞外基质合成。
　　创新：
　　首次使用BMSC条件培养基处理培养影响HSFs和KFs的增殖表型和纤维化表型，研究结果表明BMSC可能通过旁分泌的方式发挥抗瘢痕的作用，提示以BMSC作为干细胞治疗工具可能成为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的预防和治疗新方法。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要实验仪器和试剂材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要试剂与材料

2．2 实验标本的采集和分组

2．2．1 皮肤与瘢痕标本的纳入标准和排除标准

2．2．2 癜痕标本的采集

2．2．3 癜痕标本的相关资料

2．2．4 骨髓标本的采集

2．2．5 骨髓标本的相关资料

2．3 成纤维细胞及骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

2．3．1 癜痕或皮肤成纤维细胞的分离与培养

2．3．2 人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的分离与培养

2．3．3 hBMSCs的成骨、成脂分化鉴定

2．3．4 hBMSCs的干细胞标志物表达鉴定

2．4 各类条件培养基的收集与制备

2．4．1 条件培养基的分组

2．4．2 PBS条件培养基的配制

2．4．3 正常皮肤成纤维细胞条件培养基的配制

2．4．4 骨髓间充质干细胞条件培养基的配制

2．5 成纤维细胞的条件培养基处理方案

2．6 细胞增殖实验(CCK-8法)

2．7 细胞凋亡染色实验(TUNEL染色)

2．8 羟脯氨酸含量测定

2．9 细胞免疫印迹实验(In-cell western blot)

2．10 细胞免疫荧光染色

2．11 TRIzol法总RNA的提取和定量

2．12 实时定量PCR

2．13 数据统计分析

3 结果

3．1 hBMSCs的鉴定结果

3．2 hBMSC条件培养基抑制HSFs和KFs增殖

3．3 hBMSC条件培养基不影响HSFs和KFs凋亡

3．4 hBMSC条件培养基减慢HSFs和KFs迁移

3．5 hBMSC条件培养基抑制促纤维化表型相关基因和蛋白在HSFs和KFs内的表达

3．6 hBMSC条件培养基促进抗纤维化表型相关基因和蛋白在HSFs和KFs内的表达

3．7 hBMSC条件培养基抑制HSFs和KFs合成细胞外基质

4 讨论

5 结论

6 意义

附表

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的文章

Bone marrow derived mesenchymal stem cells inhibit the proliferative and profibrofic phenotype of hypertrophic scar fibroblasts and keloid fibroblasts through paracrine signaling