microRNA-182在胶质瘤诊断和预后评估中的价值及对增殖的作用研究

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 血清microRNA-182在胶质瘤患者中的表达及其临床应用价值研究
　　目的：
　　1.检测miR-182在胶质瘤患者血清中的表达水平。
　　2.分析血清miR-182表达水平与胶质瘤患者临床特征之间的关系。
　　3.评估血清miR-182表达水平在胶质瘤患者早期诊断中的价值。
　　4.研究血清miR-182表达水平对胶质瘤患者预后评估的意义。
　　方法：
　　1.qRT-PCR方法检测112例恶性胶质瘤患者与54例健康对照者的血清miR-182表达水平。比较胶质瘤患者与健康对照者及不同病理级别胶质瘤患者之间的血清miR-182表达水平差异。
　　2.评估血清miR-182表达水平与胶质瘤患者各项临床特点的相关性，主要包括:性别、年龄、肿瘤的大小、KPS评分和WHO病理分级。
　　3.分析不同组别的胶质瘤患者血清miR-182表达水平的差异。ROC曲线下面积(AUC)及ROC曲线评估血清miR-182的早期诊断价值。
　　4.随访全部患者，分析血清miR-182表达水平与胶质瘤患者的总生存率的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)的关联性。采用Kaplan-Meier分析评估血清miR-182对胶质瘤患者预后的预测价值。随后运用单变量和多变量Cox回归分析法以确定血清miR-182表达水平是否是胶质瘤患者预后的独立因素，探讨血清miR-182表达水平对胶质瘤患者预后评估的价值。
　　结果：
　　1.miR-182在胶质瘤患者血清中的表达水平分析
　　结果表明血清miR-182表达水平在胶质瘤患者组(mean±SD，2.57±1.95)明显高于健康对照组(0.97±0.38)(P＜0.001)。在WHOⅣ级的胶质瘤患者血清中，miR-182表达水平明显高于WHOⅠ级(P＜0.001)、WHOⅡ级(P＜0.001)和WHOⅢ级（P＜0.05）的患者。同时WHOⅢ级的胶质瘤患者血清miR-182表达水平明显高于WHOⅠ级（P＜0.05）的胶质瘤患者。
　　2.血清miR-182表达水平与胶质瘤患者临床特点的相关性
　　血清miR-182表达水平与胶质瘤患者KPS评分(P=0.025)和WHO病理分级((r=0.786，P=0.006)密切相关。而与胶质瘤患者性别、年龄、肿瘤的大小无统计学相关性（均P＞0.05）。
　　3.血清miR-182表达水平对胶质瘤患者的早期诊断价值
　　ROC曲线显示AUC为0.778(95％ CI，0.679-0.878)，临界值为1.56，相应的敏感度和特异度分别为58.5％和85.2％。血清miR-182水平对高级别胶质瘤的早期诊断价值分析，AUC为0.815(95％ CI，0.718-0.913)。对低级别胶质瘤的早期诊断性能分析，AUC为0.621(95％CI，0.500-0.741)，显著低于全部的胶质瘤或高级别胶质瘤（均P＜0.05）。
　　4.血清miR-182表达水平与脑胶质瘤患者预后评估的相关性分析
　　血清miR-182高水平表达组的累计5年总生存率的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)较血清miR-182低水平表达组短，其中高水平表达患者组DFS(32.786，95％CI:22.941-33.059)与低水平表达患者组DFS(44.923，95％CI:31.487-58.513)比较有显著差异（P=0.006）;高水平表达患者组OS(19.325，95％CI:9.620-20.380)与低水平表达患者OS(30.638，95％Cl:24.668-39.332)比较有显著差异(P=0.003)。单变量Cox比例风险回归模型分析显示，DFS和KPS评分显著相关(P＜0.001)，同时也与患者的WHO病理分级（P＜0.001）和血清miR-182表达水平(P=0.009)显著相关。同时结果显示OS也和KPS评分(P＜0.001)、WHO病理分级(P＜0.001)以及血清miR-182表达水平（P=0.004）显著相关。多变量Cox回归分析表明血清miR-182表达水平为DFS(P-0.034)和OS（P=0.013）的独立预后因素，而KPS评分及WHO病理分级也均为DFS和OS的独立预后因素。
　　结论：
　　1.血清miR-182表达水平在胶质瘤患者中明显升高，且与脑胶质瘤患者WHO病理分级密切相关。
　　2.血清miR-182对胶质瘤有一定的早期诊断价值，有可能成为一种潜在的肿瘤标志物。
　　3.血清miR-182表达水平和胶质瘤患者预后显著相关，对患者预后评估有一定作用。
　　第二部分 microRNA-182对胶质瘤细胞增殖的影响及作用机制研究
　　目的：
　　1.检测miR-182在U251、U118和LN319人胶质瘤细胞系和正常星形细胞中的表达情况。
　　2.分别干扰和过表达miR-182，分析miR-182对增殖作用的影响。
　　3.寻找并验证miR-182下游目标靶基因，研究抑制和过表达miR-182后对下游目标靶基因和蛋白表达水平的影响。
　　4.分别干扰和过表达miR-182下游靶基因，研究其对人胶质瘤细胞系增殖作用的影响。
　　5.分别干扰和过表达miR-182及下游靶基因，探讨miR-182-下游靶基因在胶质瘤细胞增殖中的作用机制。
　　方法：
　　1.qRT-PCR检测miR-182在3种胶质瘤细胞系和正常星型细胞中的表达
　　培养胶质瘤细胞系U251、U118、LN319和正常星型细胞，qRT-PCR方法检测miR-182在U251、U118、LN319胶质瘤细胞系和星型细胞中的表达情况。
　　2.观察miR-182对胶质瘤细胞的增殖能力的影响
　　采用脂质体Lipofectamine2000瞬时转染方法按要求对U251胶质瘤细胞进行转染，分别干扰和过表达miR-182。qRT-PCR方法检测转染效率。WST-1方法在第24小时、48小时、72小时和96小时对细胞的增殖能力进行检测。
　　3.寻找并验证miR-182在胶质瘤细胞中的下游目标靶基因，研究干扰和过表达miR-182对靶基因转录水平及靶蛋白表达水平的影响
　　运用microRNAs和miRBase等生物信息学数据库搜索miR-182的潜在目标靶基因，应用荧光素酶报告基因系统进行验证。运用qRT-PCR和Western blot方法分别检测miR-182对靶基因转录及蛋白表达水平的影响。
　　4.分别干扰和过表达靶基因，研究其对人胶质瘤细胞增殖作用的影响
　　分别干扰和过表达靶基因。运用qRT-PCR和Western blot验证干扰效率及过表达效率。WST-1方法对细胞进行增殖能力检测。
　　5.探讨miR-182通过调控FOXO3在调节胶质瘤细胞增殖中的作用机制。
　　分别干扰和过表达miR-182、干扰和过表达FOXO3，瞬时转染后48小时采用WST-1方法检测增殖能力，探讨miR-182及其下游靶基因FOXO3在胶质瘤细胞的增殖活动中的分子作用机制。
　　结果：
　　1.miR-182在胶质瘤细胞系和正常星形细胞中的表达
　　结果显示miR-182在胶质瘤细胞中的表达水平分别为LN319(0.1±0.05)、U118(0.08±0.03)、U251(0.24±0.05)，明显高于正常星形细胞NHA(0.06±0.01)（均P＜0.01）。
　　2.miR-182对胶质瘤细胞的增殖的影响
　　分别将miR-182的mimics及inhibitor转染到胶质瘤细胞系U251中:与对照组比较，siRNA-miR-182表达明显下调(P=0.015)，而miR-182 mimics表达明显上调(P＜0.001)。
　　3.寻找并验证miR-182目标靶基因
　　应用miRBase等数据库搜索到miR-182的潜在目标靶基因之一为FOXO3，且靶基因FOXO3的3'-UTR区存在两个高度保守的碱基序列，能与miR-182特异性结合。
　　4.FOXO3对人胶质瘤细胞U251的增殖作用。
　　qRT-PCR和Western blot验证FOXO3干扰效率及过表达效率满意。研究结果显示干扰FOXO3表达可上调胶质瘤细胞的增殖（1.40±0.04倍，P=0.006），而过表达FOXO3则可降低胶质瘤细胞的增殖（23.8％±2.44％，P=0.005）。
　　5.miR-182通过调控靶基因FOXO3参与胶质瘤细胞的增殖作用调节
　　分别干扰和过表达miR-182及其下游靶基因FOXO3，研究结果显示:过表达miR-182诱导的胶质瘤细胞增殖可被过表达FOXO3拮抗（P＜0.001），而过表达miR-182与siRNA-FOXO3联合作用，则细胞增值上调作用更显著（P=0.018）。
　　结论：
　　1.miR-182在人胶质瘤细胞系中高表达，可显著上调胶质瘤细胞的增殖。
　　2.FOXO3是miR-182的目标靶基因之一，参与调节胶质瘤细胞的增殖。
　　3.miR-182通过调控FOXO3来促进胶质瘤细胞的增殖。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 血清microRNA-182在胶质瘤患者中的表达及其临床应用价值研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 microRNA-182对胶质瘤细胞增殖的影响及作用机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

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