Slc33a1基因S113R杂合突变导致小鼠遗传性痉挛性截瘫和BMP信号通路增强

摘要

SLC33A1（solute carrier family33，memberl）又称乙酰辅酶A转运体（Acetyl-Coenzyme A transporter1，AT-1），是位于内质网上的含有549个氨基酸的多次跨膜蛋白，其主要功能是将细胞质中的乙酰辅酶A转运至内质网腔中，为内质网中蛋白的乙酰化修饰提供原料。2008年我们实验室用连锁分析的方法将青岛一常染色体显性遗传性痉挛性截瘫(hereditary spasticparaplegia，HSP)家系的致病位点定位于该基因所在区域，并将该HSP位点命名为SPG42(MIM＃612539)。其后通过全基因组外显子测序发现该家系患者患病是由SLC33A1 p.Ser113Arg(S113R)(c.339T＞G)(MIM＃603690.0001)错义突变导致的。
　　借助动物模型，可以从体内整体水平研究疾病的发生、发展规律，为疾病的预防和治疗提供理论依据，有助于人们发掘新的治疗药物和治疗手段。小鼠基因组与人类基因组同源性极高，小鼠模型被广泛用于研究人类基因的功能以及基因突变与疾病的关系。因此，本实验室于2013年构建了Slc33a1S113R基因敲入小鼠模型。对该转基因小鼠胚胎进行基因型分析发现，纯合突变小鼠（Slc33a1mut'mut）胚胎早期致死，杂合突变（Slc33a1wt/mut）小鼠能存活。为了进一步明确Slc33a1S113R突变的致病机制，该论文中我们分析了Slc33a1S113R突变对Slc33a1wt/mut小鼠神经系统的影响及其作用机制，并利用坐骨神经损伤模型和背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)体外培养体系在体内和体外两个水平对Slc33a1wt/mut小鼠的外周神经损伤修复能力及其机制进行了研究，研究内容及结果分为以下四个部分:
　　第一部分：Slc33a1wt/mut小鼠表现出遗传性痉挛性截瘫表型
　　遗传性痉挛性截瘫是一类具有高度遗传和临床异质性的神经退行性或发育性疾病，以双下肢无力和肌痉挛为主要临床表现，以双侧皮质脊髓束远端轴突变性和脱髓鞘为常见病理改变。鉴于人类SPG42患者发病年龄晚，我们重点评估了老龄小鼠的运动功能和神经系统表型。
　　我们首先用后肢抱握反射实验粗略评估了8-24个月龄小鼠的下肢运动功能，结果显示，8-24个月龄Slc33a1wt/mut小鼠的后肢抱握反射与同龄WT小鼠相比无明显差异。但是，利用转棒实验和运动耐量试验进行分析，我们发现12个月龄的Slc33a1wt/mut小鼠与同龄WT小鼠相比，出现明显的运动协调能力和抗疲劳耐受能力下降。
　　接着，我们对12个月龄小鼠的脊髓进行了组织学分析（包括组织免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色、勒克司坚牢蓝染色和透射电镜检查），结果发现，Slc33a1wt/mut小鼠腰段脊髓皮质脊髓束中出现明显的退行性改变，表现为轴突密度减低、髓鞘变性和轴突形态异常等。另外，透射电镜结果显示，Slc33a1wt/mut小鼠腰段脊髓灰质区胶质细胞和神经元呈现显著的退行性改变，包括线粒体肿胀及嵴缺失、游离核糖体增多、内质网异常、核袋形成和高尔基体肿胀等异常表型。
　　最后，我们对12个月龄小鼠的坐骨神经进行组织学分析，结果未发现Slc33a1wt/mut小鼠的坐骨神经存在明显异常，对Slc33a1wt/mut小鼠的腓肠肌进行病理学分析也未检测到明显异常，这提示Slc33a1wt/mut小鼠的外周神经系统尚无显著异常。另外，尽管以往的报道提示SLC33A1突变可以导致白内障、耳聋和铜代谢异常，我们针对这些表型进行检测和观察，结果未检测到Slc33a1wt/mut小鼠存在血浆铜蓝蛋白活性异常和白内障及耳聋等异常表型。
　　可见，Slc33a1wt/mut小鼠存在单纯型HSP的相关表型，即运动功能异常和中枢神经系统退行性改变，而外周神经系统无明显异常。这与人类SPG42患者的表型是类似的。因此，该模型可以做为探索HSP发病机制和治疗方法的实验动物模型。
　　第二部分：Slc33a1wt/mut小鼠神经系统BMP信号通路分析
　　之前报道的至少有5个SPG基因编码蛋白能调控BMP信号通路，包括atlastin-1(SPG3A)、spastin(SPG4)、NIPA1(SPG6)、spartin(SPG20)和PNPLA6(SPG39)，因此，BMP信号通路异常被认为是HSP的发病机制之一。
　　之前我们实验室用斑马鱼和人皮肤成纤维细胞对SLC33A1功能进行研究的结果显示:SLC33A1是BMP信号通路的负调控因子，在敲低Slc33a1的斑马鱼中或发生SLC33AlS113R突变的人皮肤成纤维细胞中均存在BMP信号通路增强的现象，这提示SLC33AlS113R突变导致SPG42的机制可能是通过影响BMP信号通路。
　　为了检测Slc33a1S113R突变在鼠类中是否会影响BMP信号通路，我们首先用Western blotting方法分析了12个月龄小鼠脊髓中BMPR1A的水平，结果发现Slc33a1wt/mut小鼠脊髓中BMPR1A的水平显著高于WT小鼠。由于之前多项研究表明当神经系统发生损伤病变时，BMP信号通路会上调，所以为了排除Slc33a1wt/mut小鼠中BMPR1A上调是中枢神经系统发生退行性改变的后果，我们又检测了尚未发生退行性改变的新生鼠以及3个月龄小鼠中BMPR1A的表达情况，结果发现Slc33a1wt/mut新生鼠脊髓中BMPR1A的水平也显著高于同龄WT小鼠，这说明Slc33a1wt/mut小鼠脊髓中BMPR1A水平改变不是神经退行性改变的后果，而是由于Slc33a1基因突变所致。
　　尽管在体内水平，我们无法用Western blotting方法检测到小鼠脊髓中pSmad1/5/8的表达变化，但在分离培养的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonicfibroblasts，MEF)和原代培养皮层神经元中，Slc33a1wt/mutMEF和皮层神经元中BMPR1A以及BMP信号下游效应分子pSmad1/5/8的水平在Slc33a1wt/mut小鼠均有升高。这说明在细胞水平，Slc33a1S113R突变就足以对BMP信号通路造成影响。
　　此外，我们还检测到Slc33alwt/mut小鼠大脑、小脑和脊髓中BMPR2的表达水平显著高于WT小鼠，而Slc33a1wt/mutMEF中BMPR2的水平与野生型MEF无明显改变，这提示BMPR1A升高是Slc33a1S113R突变对细胞的固有影响，而BMPR2升高可能是机体在整体水平协调作用的结果。
　　第三部分：Slc33a1S113R通过BMP信号通路影响小鼠坐骨神经损伤修复速度
　　研究表明BMP信号通路在神经系统的再生中发挥作用，因此我们推测，SLC33A1突变导致的BMP信号通路上调可能会影响外周神经再生修复。
　　为验证以上假设，我们首先用小鼠坐骨神经损伤模型在体内水平研究了Slc33alS113R杂合突变对外周神经系统损伤后再生修复的影响。我们从计算坐骨神经功能指数(SFI)和组织学分析两个方面评价了小鼠的坐骨神经损伤后修复速度。SFI结果显示:与WT小鼠相比，Slc33a1wt/mut小鼠的坐骨神经损伤后功能恢复速度明显加快。组织学分析结果显示:Slc33a1wt/mut小鼠和WT小鼠损伤侧坐骨神经中均有细小的轴突及薄髓鞘再生，但是Slc33a1wt/mut小鼠中有髓轴突数目比WT小鼠明显增多。这些结果均提示Slc33a1wt/mut小鼠坐骨神经损伤后修复速度加快。
　　接着，我们分析了Sl c33a1wt/mut小鼠坐骨神经损伤后再生修复速度加快与BMP信号通路的关系。我们首先检测到Slc33a1wt/mut小鼠坐骨神经中BMPR1A的水平比WT小鼠高，并且在坐骨神经损伤后会进一步增高。除此之外，WT小鼠坐骨神经损伤两天后，SLC33A1的表达水平在损伤的坐骨神经中显著下降，这与SLC33A1是BMP信号通路的负调控因子相对应。
　　最后，为了进一步验证BMP信号通路改变是Slc33a1wt/mut小鼠坐骨神经损伤修复加快的重要因素，我们用BMP信号通路的内源性拮抗剂Noggin做了拯救实验，即对小鼠坐骨神经进行钳夹损伤前，向欲损伤部位近端的神经鞘膜内显微注射Noggin，两天后，用组织免疫荧光染色和针刺实验两种方法评价坐骨神经损伤后的修复情况。结果显示，外源性应用BMP拮抗剂Noggin能逆转Slc33a1wt/mut小鼠坐骨神经再生和功能恢复速度加快的现象。这说明至少在一定程度上，Slc33a1突变所引起的Slc33a1wt/mut小鼠外周神经损伤修复速度加快是通过BMP信号通路介导的。
　　第四部分：Slc33a1S113R通过BMP信号通路影响体外培养DRG神经元的轴突生长
　　背根神经节(DRG)再生系统被广泛用于研究感觉神经元的轴突再生，分离培养的DRG神经元可以从单细胞水平评估神经元的轴突生长情况，而DRG外植体保持了神经元和其周围非神经元细胞之间的联系。有研究表明BMP信号通路可以增强DRG神经元的轴突再生潜能。在此我们研究了Slc33alS113R杂合突变是否会通过影响BMP信号通路影响感觉神经元的轴突再生。
　　我们首先对比分析了Slc33a1wt/mutDRG与野生型DRG中BMP信号通路相关蛋白的表达水平。细胞免疫荧光分析结果显示Slc33a1wt/mutDRG神经元中BMPR1A和pSmad1/5/8的水平高于野生型DRG神经元。
　　接着，我们用DRG体外培养体系在体外水平研究了Slc33a1S113R杂合突变对外周感觉神经元轴突再生情况的影响。实验结果显示，培养48小时后，Slc33a1wt/mutDRG外植体和Slc33a1wtmutDRG离散神经元的轴突长度均长于野生型，这提示Slc33a1S113R杂合突变导致DRG轴突生长加快是神经元的自主改变。
　　最后，为了进一步明确BMP信号通路改变是Slc33a1wt/mut DRG轴突生长加速的重要因素，我们用Noggin做了拯救实验。结果发现，用Noggin处理能逆转DRG外植体和DRG神经元轴突生长加速的现象。
　　以上结果说明，在体外水平，Slc33a1S113R杂合突变能通过改变BMP信号通路加快DRG神经元轴突的生长，用Noggin处理能拯救Slc33a1wt/mutcDRG轴突生长加速的表型。
　　综上所述，Slc33a1wt/mut小鼠出现HSP的相关表型，Slc33a1wt/mut小鼠可以作为研究HSP的疾病动物模型;Slc33a1S113R突变导致BMP信号通路增强与SPG42的发病相关;与野生型小鼠相比，Slc33a1wt/mut小鼠外周运动和感觉神经损伤后再生能力和功能修复能力明显增强，这与Slc33a1wt/mut小鼠神经系统中BMP信号通路增强有关。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、遗传性痉挛性截瘫的研究现状

二、SLC33A1概述

三、BMP信号通路及其在神经系统中的作用概述

第一部分 Slc33a1wt／mut小鼠表现出遗传性痉挛性截瘫表型

材料和方法

结果

讨论

第二部分 Slc33a1wt／mut小鼠神经系统BMP信号通路分析

材料和方法

结果

讨论

第三部分 Slc33a1s113R通过BMP信号通路影响小鼠坐骨神经损伤修复速度

材料和方法

结果

讨论

第四部分 Slc33a1s113R通过BMP信号通路影响体外培养DRG神经元的轴突生长

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

致谢

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