SIRT2基因启动子在心肌梗死病人中遗传和功能变异研究

摘要

背景：急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉性疾病(CAD)急性发作的一种表现形式，主要是由不稳定性动脉粥样硬化斑块破裂所致。目前已知关于动脉粥样硬化的病理机制主要涉及细胞炎症、氧化应激、血小板功能等多个代谢过程。尽管前期全基因组关联研究(GWAS)发现CAD的发生与遗传变异有关，但这些遗传变异仅能解释10％的CAD发生。目前认为低频率以及罕见的遗传变异可能与冠心病的发生有关。SIRT2属于sirtuin蛋白家族的一员，主要存在于哺乳动物体内，是一种高度保守依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。SIRT2在基因组稳定性、新陈代谢、炎症、氧化应激、自噬以及在调节血小板及血管内皮功能方面发挥着重要的作用。在基因表达过程中，启动子可调节基因表达水平变化，因此，本研究推测SIRT2基因的遗传变异在AMI的发病机制中可能存在重要的作用，力求通过研究SIRT2基因启动子区域的遗传变异所引起的基因表达水平的变化来探讨AMI的发生与SIRT2基因的关系。
　　目的：在两组人群中通过测序探讨低频遗传变异以及单核苷酸多态性(SNPs)对AMI组和对照组人群发病的影响;其次通过构建携带SIRT2基因野生型及遗传变异位点启动子的pGL3-basic报告基因载体，检测遗传变异导致的基因表达水平的变化。通过对SIRT2基因启动子遗传及功能变异的研究，探讨SIRT2基因在AMI发病机制中的作用。
　　方法：⑴纳入375例新发AMI病例和377例健康对照人群，分别收集两组人群临床基线资料并提取全基因组DNA。⑵根据NCBI基因数据库提供的人SIRT2基因启动子序列设计引物，采用PCR方法扩增SIRT2基因启动子目的片段，直接测序后统计分析SIRT2的基因序列变异。⑶将测序发现的携带SIRT2基因启动子序列变异位点及野生型目的基因片段构建到pGL3-basic报告基因载体，将构建好的pGL3-basic报告基因载体及内参质粒pRL-TK通过脂质体共转染HEK293及H9c2细胞，通过Promega双荧光报告基因分析仪分析SIRT2基因启动子的相对荧光素酶活性，检测基因遗传变异导致基因启动子转录活性的变化。
　　结果：①通过测序，共发现17个DNA序列变异(DSVs)位点，包括5个SNPs位点。其中发现3个新的杂合DSVs，分别为g.38900270A＞G、g.38899853C＞T和g.38900888_91 delTAAA，仅存在于3个AMI病人中，在正常对照组中尚未发现。在对照组中发现5个新的DSVs，分别为g.38900562C＞T，g.38900413A＞C，g.38900030G＞A，g.38899925A＞C和g.38899852C＞T，而在AMI组中未发现上述DSVs。其余4个新的杂合突变位点和5个SNPs在对照组及AMI组中均有发现，但无统计学意义(P＞0.05)。②成功构建pGL3-basic报告基因载体，分别为pGL3-WT（野生型SIRT2基因启动子）、pGL3-38900907G、pGL3-38900888_91 del、pGL3-38900562T、pGL3-38900413C、pGL3-38900291G、pGL3-38900270G、pGL3-38900030A、pGL3-38899925C、pGL3-38899903C、pGL3-38899853T、pGL3-38899852T和pGL3-38899781G。③通过脂质体体外瞬时转染HEK293及H9c2细胞，检测携带不同DSVs的SIRT2基因启动子的相对荧光素酶表达活性：在HEK293细胞中，仅在AMI组中发现DSVs可影响SIRT2基因启动子转录活性:g.38900888_91delTAAA(P＜0.05)和g.38900270A＞G(P＜0.01)可显著降低SIRT2基因启动子的转录活性;g.38899853C＞T显著增加SIRT2基因启动子的转录活性(P＜0.01)。将仅在对照组中发现5个DSVs(g.38900562C＞T,g.38900413A＞C，g.38900030G＞A，g.38899925A＞C和g.38899852C＞T)转染至HEK293细胞后，尚未发现可显著改变SIRT2基因启动子的转录活性(P＞0.05)。同时4个 DSVs[g.38900907A＞G(rs4803006),g.38900291C＞G(rs2053071)，g.38899903T＞C和g.38899781C＞G]均存在于对照组及AMI组中，将其相应的表达载体转染至HEK293细胞后，仍未发现可显著改变SIRT2基因启动子的转录活性(P＞0.05)；将AMI组中发现的g.38900888_91 delTAAA和g.38900270A＞G转染至H9c2细胞中，发现可显著降低SIRT2基因启动子的转录活性(P＜0.01);g.38899853C＞T转染后可显著增加SIRT2基因启动子的转录活性(P＜0.01)。在AMI组及对照组出现相似频率的位点g.38900907A＞G(rs4803006)和g.38900291C＞G(rs2053071)转染至H9c2细胞后，未发现可显著改变SIRT2基因启动子的转录活性(P＞0.05)。
　　结论：通过对SIRT2基因启动子遗传及功能学变异的研究发现，在AMI病例中发现的低频序列变异位点可能会影响SIRT2基因的转录活性，导致其表达水平的变化，进而在心肌梗死的发生发展中起着重要的作用，为心肌梗死的预防和治疗提供了潜在的靶点。

目录

声明

摘要

符合说明

前言

1．实验材料及研究对象

2．实验方法

3．统计学分析

结果

1．AMI组与对照组的临床特征及生化指标分析

2．SIRT2基因启动子部分片段PCR扩增及测序结果

3．JASPAR program分析结果

4．SIRT2基因启动子全长PCR扩增鉴定结果

6．构建SIRT2-pGL3表达载体

7．SIRT2基因启动子DSVs功能检测

讨论

结论

参考文献

文献综述 SIRT2基因基本生理功能及在心血管疾病中的研究现状

附录、附图表

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文