一种节杆菌来源的透明质酸酶的研究

摘要

透明质酸是一种高分子酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质中。透明质酸在炎症、创伤愈合、血管再生等方面发挥重要的作用。透明质酸分子量范围十分广泛。透明质酸的生理功能与其分子量大小和在何种情况下合成密切相关。目前商品大分子量透明质酸主要通过微生物发酵法获得，极少数来源于动物组织提取。低分子量透明质酸通过物理或者化学的方法降解透明质酸获得。这些方法反应条件剧烈，往往会破坏单糖的残基结构，同时随机降解糖苷键，因此无法获得均一的透明质酸。使用酶解法制备小分子透明质酸，条件温和，特异性降解糖苷键，可以获得高质量透明质酸，因此备受人们关注。
　　透明质酸酶是主要降解透明质酸的一类糖苷酶。最初作为“扩散因子”被发现，之后作为药物渗透剂促进药物吸收、手术后水肿消散和局部麻醉效果等。除了动物睾丸和毒液中，越来越多的微生物已被报道可以产生透明质酸酶。但动物来源的透明质酸酶原料有限，微生物制备透明质酸酶越来越受到关注。虽然已经发现很多微生物都可以产生透明质酸酶，但酶的活性都普遍偏低，主要原因是产酶量低。本研究对菌株基因组进行了测序，通过基因组分析获得编码透明质酸酶的氨基酸序列，并使用SDS-PAGE、Native-PAGE和质谱对此序列进行了验证。并对透明质酸酶家族的活性架构进行了生物信息学分析。设计了重组载体，完成了此透明质酸酶的外源表达和重组透明质酸酶的分离纯化及酶学性质研究。最后使用荧光辅助糖电泳法对酶解产物进行了研究。
　　1.菌株基因组测序和序列分析
　　基因组测序的结果显示菌株基因组大小为4174362 bp，含有基因4568条。经过分析注释获得一条可能为编码透明质酸酶的基因。此基因编码的蛋白分子量约83 kDa，等电点为6.55。
　　2.电泳和质谱对获得的编码序列进行验证
　　首先对培养48 h的野生型菌株的发酵上清液进行超滤离心，然后进行电泳检测。SDS-PAGE结果显示在83 kDa附近有蛋白条带。活性电泳检测结果表明，发酵上清液具有透明质酸酶酶活，同时只有一条活性条带，说明此菌株表达且只表达一种透明质酸酶。胞外蛋白质谱结果分析表明有29条肽段与注释出来的编码序列高度匹配，说明细菌表达了注释基因编码的蛋白。基因组分析获得的基因为编码透明质酸酶的基因。
　　3.透明质酸酶活性架构的生物信息学分析
　　在CAZy数据库中，透明质酸酶主要属于GH56和PL8家族。分析活性架构区域的序列与结构特征对于研究透明质酸酶的作用机理具有重要意义。本文对这两个家族的透明质酸酶活性架构的氨基酸进行了分析，并制作了活性中心序列谱。
　　4.透明质酸酶的外源表达和纯化
　　选取pET-28a作为载体，大肠杆菌(BL21)为工程菌。在20℃，200rpm，1 mM IPTG的条件下，构建的表达菌株(BL21)成功表达出可溶性透明质酸酶。使用不同浓度的咪唑洗脱液对镍柱进行洗脱，在100 mM咪唑洗脱液洗脱时可以获得电泳纯透明质酸酶，此酶可以用于后期研究。
　　5.重组透明质酸酶的酶学性质研究
　　(1)温度和pH对重组HAase的影响
　　重组透明质酸酶最适反应温度为42℃，在37℃和42℃之间酶活均很高，且稳定性较好。50℃保温10 min，酶活仅剩约10％。重组透明质酸酶最适pH为6.5，pH5.5-8.0时，酶的稳定性较高，室温放置2h酶活依然可以保留在80％以上。当pH大于9.0或小于4.0时，重组透明质酸酶完全失活。
　　(2)不同浓度的NaCl和NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液对酶活的影响
　　当NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液浓度为5 mmol/L时酶活最高，但是对于酶活的提升并不明显，仅提高约16％。但稍高一点的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液对酶活产生了抑制效果，当NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度达到200 mmol/L时酶活降低到80％以下。NaCl浓度为5 mmol时酶活显示最高，随着浓度的增加酶活有一定下降但总的来说添加适当的NaCl对酶活有提升作用(最高浓度只做到了200 mmol/L)。
　　(3)金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响
　　Ca2+、Mg2+、Ba2+对酶活具有促进作用;酶液中含有100 mmol/LBaCl2时，酶活最高(约为168％)。10 mmol/L的Cu2+和Zn2+可以明显的抑制酶的活性，其中Cu2+可以使酶完全失活，Zn2+则使酶活减少近80％。10 mmol/L的EDTA对酶活基本不产生影响，但是当浓度增加到100 mmol/L，重组透明质酸酶的活性明显降低，大约减少80％。
　　非离子型表面活性剂Triton X-100的加入对酶活产生了一定的抑制作用，但酶活的降低并不明显，2％ Triton X-100室温处理酶液30 min酶活仍能保留80％以上。但是离子型表面活性剂SDS在0.5％浓度下就可以使重组透明质酸酶完全失活。
　　(4)重组透明质酸酶的底物特异性研究
　　重组透明质酸酶特异性降解透明质酸，不能降解硫酸软骨素、肝素和羧甲基纤维素钠。
　　(5)重组透明质酸酶降解透明质酸的酶动力学研究
　　重组透明质酸酶的Km和Vmax分别为4.985 mg/mL和0.4071μm/mL/min。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

1．1 透明质酸简介

1．2 透明质酸的生物活性

1．3 HA的生物医学应用

1．4 透明质酸寡糖

2 透明质酸酶

2．1 透明质酸酶简介

2．2 透明质酸酶的分类

2．3 真核生物来源的透明质酸酶

2．4 微生物(细菌)来源的透明质酸酶

2．5 透明质酸酶的医学应用

2．6 透明质酸酶活性检测方法

3 立题依据

第二章 菌株基因组测序及序列分析

1 实验材料、试剂与仪器

1．1 主要试剂与仪器

1．2 数据库及分析软件

2 实验方法

2．1 节杆菌全基因组草图的测序

2．2 编码透明质酸酶核酸序列的获得

2．3 胞外表达谱研究

3 结果与分析

3．1 基因组测序结果分析

3．2 发酵上清液SDS-PAGE检测

3．3 发酵上清液Native-PAGE检测

3．4 质谱结果分析

4 小结

1 实验材料与方法

1．1 生物信息学分析软件与网站

1．2 数据获取及筛选

1．3 序列比对与结构比对

1．4 氨基酸频率统计

1．5 透明质酸酶家族活性中心序列谱

2 结果与分析

2．2 PL8家族中透明质酸酶的活性架构区域

2．3 透明质酸酶活性架构部位氨基酸使用频率

2．4 透明质酸酶活性架构序列谱

第四章 酶的外源表达

1 菌株与质粒

2 主要的仪器

3 主要培养基和试剂

4 实验方法

4．1 引物的设计和合成

4．2 重组载体的模拟构建

4．3 PCR获得目的基因

4．4 目的基因与载体酶切

4．5 重组扩增菌株的构建

4．6 重组质粒的酶切验证

4．7 重组表达菌株的构建及重组蛋白的诱导表达

4．8 目的蛋白的分离纯化

5 结果与分析

5．2 目的基因和pET-28a(+)载体的酶切

5．3 菌液PCR验证

5．4 重组质粒的酶切验证

5．5 目的基因PCR正确性验证

5．6 SDS-PAGE检测透明质酸酶基因的表达情况

5．7 重组透明质酸酶的纯化

5．8 重组透明质酸酶的Native-PAGE

6 小结

第五章 重组透明质酸酶的酶学性质研究

1 实验材料、试剂与仪器

2 试验方法

2．1 相对酶活的测定

2．2 最适反应温度测定

2．3 重组透明质酸酶的热稳定性实验

2．4 最适反应pH测定

2．5 pH稳定性试验

2．7 NaCl浓度对重组酶酶活的影响

2．8 金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响

2．9 底物特异性研究

2．10 重组透明质酸酶的酶动力学研究

3 荧光辅助糖电泳(FACE)研究重组透明质酸酶酶解产物谱

3．1 重组透明质酸酶与HA溶液的反应

3．2 电泳

4 结果与分析

4．1 最适反应温度及热稳定性

4．2 最适反应pH及不同pH下酶的稳定性

4．3 不同浓度的NaCl和NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液对酶活的影响

4．4 金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响

4．5 重组透明质酸酶的底物特异性研究

4．6 重组透明质酸酶降解HA的酶动力学研究

4．7 FACE法研究重组透明质酸酶降解产物

5 小结

总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文