大泷六线鱼分子标记的开发、生长性状的关联性分析及遗传多样性研究

摘要

大泷六线鱼（Hexagrammos otakii，Fat greenling），别称欧式六线鱼，是近海冷温性底层鱼类，分布范围主要集中于太平洋西北部的近海岩礁底层，是一种十分具有发展潜力的经济鱼种。本研究针对大泷六线鱼，首先利用线粒体标记，分析了不同地理群体间、野生和养殖群体间的多态性差别及亲缘关系，并进一步利用2b-RAD技术结合高通量测序，开发了大泷六线鱼与生长发育相关的SSR标记20个和SNP标记21个，并进行了SNP标记与生长发育性状的相关性分析。
　　利用线粒体DNA的细胞色素b(cytb)和控制区(D-loop)的部分序列研究大泷六线鱼4个群体（包括野生和养殖群体）的遗传多样性。PCR扩增后分别得到365 bp(cytb)和387 bp(D-loop)的碱基序列。Mega计算结果显示cytb中A+T的含量(52.6％)高于G+C的含量(47.3％);D-loop中A+T的含量(69.3％)同样高于G+C的含量(30.7％)。4个群体平均的变异位点、单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数，cytb基因分别为10，7.75，0.739，0.0073和2.656; D-loop区分别为为18.25，12.75，0.846，0.0121和4.673。4个群体的遗传多样性由高到低分别为舟山、大连、琅琊台、即墨养殖群体，养殖群体的多样性低于野生群体。基于野生群体cytb和D-loop的分子变异分析(AMOVA)得出的Fst分别为0.3186和0.2714，显示了变异主要发生在群体内部。基于Kimura2-parameter模型构建的NJ树结果表明3个野生群体间没有显著的分化。线粒体cytb基因和D-loop区均可作为检测大泷六线鱼遗传多样性的有效标记。
　　2b-RAD技术与高通量测序结合，对大泷六线鱼进行简化基因组测序，共产生4，366，696个reads，测序碱基数2，183，348，000bp，测序质量Q20为87.6％，Q30为83.11％。共测得847，818条序列标签，序列标签总长度26，948，6497bp的。共发现了130494个SSR位点。经blast比对，筛选其中稳定扩增并与生长发育相关的位点，在大泷六线鱼中筛选得到20个微卫星位点，并分别在来自四个群体的105尾大泷六线鱼中进行扩增，毛细管电泳检测其多态性。20个位点的等位基因数从8个到26个不等，平均19.95个。PIC平均值为0.7555，从0.1659到0.9227。观测杂合度和期望杂合度分别为观测杂合度0.0667～0.8571和0.1710～0.9314。除HO6位点外其余19个位点均具有较高的多态性。将开发的20个微卫星位点在相近物种，30尾斑头六线鱼中进行微卫星位点扩增，其中10个微卫星位点(HO1，HO3，HO4，HO5，HO9，HO14，HO17，HO18，HO19，HO20)可以在斑头六线鱼中进行扩增。
　　实验共发现158，733个SNP，通过blast比对筛选其中与生长发育相关且位于编码区域的SNP位点，共得到21个SNP位点，并在138尾大泷六线鱼个体中进行了验证。结果显示，其中17个位点具有多态性，观测杂合度平均值0.2666，分布大小从0.0687到0.5115，期望杂合度从0.0666到0.6815，平均值0.3005。HOS2、HOS6、HOS14三个位点偏离HW平衡，HOS19最小等位基因频率小于0.05，得到的17个多态性位点中13个具有深入研究的价值，可以用于大泷六线鱼多态性检测以及其他遗传学数据的分析。关联性分析得出HOS17的GG基因型对于体重增长有着显著性影响，HOS13的TT基因型与HOS21的GA基因型与该位点的其它基因型相比，对体长增长有着显著性影响，HOS18的TT基因型则对体重体长增长都有影响，对体长增长有及其显著的影响。

目录

声明

摘要

缩略词

1．1．1 大泷六线鱼简介

1．1．2 大泷六线鱼形态学特征

1．1．3 大泷六线鱼生物学特征

1．1．4 大泷六线鱼行为学研究

1．1．5 大泷六线鱼遗传学研究

1．1．6 我国其他六线鱼科鱼类概况

1．2 常用的鱼类遗传多样性分子标记

1．2．1 线粒体DNA

1．2．2 微卫星标记

1．2．3 单核苷酸多态性

1．3 研究的目的及意义

第二章 大泷六线鱼群体线粒体序列分析

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 mtDNA Cytb序列分析结果

2．3．2 mtDNA D-loop序列分析结果

2．4 讨论

2．4．1 大泷六线鱼遗传多样性和遗传分化分析

2．4．2 野生群体地理分化分析

2．5 本章小结

第三章 大泷六线鱼微卫星多样性分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果

3．3．1 大泷六线鱼SSR位点的分布特征

3．3．2 微卫星多态性检测

3．3．3 在相近物种中的应用

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 大泷六线鱼单核苷酸多态性及与生长发育的关联性分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果

4．3．1 大泷六线鱼SNP位点的分布特征

4．3．2 SNP多态性

4．3．3 关联性结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表和撰写的学术论文目录