FBXO31介导Snail1泛素化降解抑制胃癌上皮-间质转化的研究

摘要

研究背景:
　　胃癌(GC)是世界常见的恶性肿瘤之一，在癌症相关死亡中位居第三位，我国是胃癌高发区。胃癌患者生存期短、易复发，肿瘤的侵袭转移是造成胃癌预后差的重要原因。目前认为上皮-间质细胞转化(EMT)在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用，过程中有多种转录因子(EMT-TFs)的参与，这些EMT-TFs是高度不稳定的蛋白，易被蛋白酶体途径泛素化降解。
　　FBXO31是F-box蛋白家族成员，参与Skp1-Cullin-F-box(SCF)泛素E3连接酶复合物的形成，能够介导泛素依赖性蛋白酶体降解途径和调节信号转导。我们前期研究发现在胃癌组织中FBXO31的mRNA和蛋白水平明显降低，且低表达与胃癌患者预后差、存活期限短等密切相关。进一步的研究发现，FBXO31高表达能够显著抑制人胃癌细胞的转移侵袭能力，但具体的机制有待进一步研究。
　　研究目的:
　　1.探究FBXO31对胃癌细胞侵袭转移能力的调控机制;
　　2.探讨FBXO31能否通过泛素化依赖性途径降解EMT-TFs，并确定FBXO31与EMT-TFs间相互作用的关键结构域及分子机制。
　　实验方法:
　　1.分子及细胞水平的研究
　　1.1.人胃癌细胞转染FBXO31 siRNA，观察细胞表型变化。然后，将FBXO31 siRNA及高表达质粒分别转染胃癌细胞，细胞划痕和Transwell实验检测FBXO31干扰和高表达对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。
　　1.2.FBXO31 siRNA和高表达质粒分别转染人胃癌细胞，qRT-PCR和Western blot检测细胞中不同EMT-TFs在mRNA和蛋白水平的变化。
　　1.3.将FBXO31表达载体Myc-FBXO31及F-box结构域缺失的载体Myc-△FBXO31分别与EMT-TF Snail1的表达载体Flag-Snail1共转染胃癌细胞，Western blot和Co-IP检测FBXO31与Snail1的相互作用，并通过泛素化实验检测FBXO31能否引起Snail1的泛素化降解。
　　1.4.Myc-FBXO31高表达载体分别与Flag-Snail1的野生型和磷酸化位点突变的载体共转染胃癌细胞，Co-IP检测Snail1的降解是否需要发生磷酸化。
　　2.动物水平的研究
　　构建筛选FBXO31高表达的稳转细胞系(BGC-FBXO31)，对裸鼠尾静脉注射，6周后观察并分析裸鼠体内肺转移的情况。
　　3.临床标本的研究
　　收集77例人胃癌及对应癌旁组织，Western blot检测组织中FBXO31与Snail1的表达并分析二者的相关性。
　　实验结果:
　　1.分子及细胞水平
　　1.1.胃癌细胞FBXO31干扰后细胞呈现长梭形，细胞间粘着性降低。细胞划痕和Transwell实验结果表明，FBXO31沉默能促进胃癌细胞侵袭转移，FBXO31高表达能抑制胃癌细胞侵袭转移。
　　1.2.FBXO31 siRNA和高表达质粒转染胃癌细胞，EMT-TF Snail1在mRNA水平没有变化，在蛋白水平可被FBXO31下调。
　　1.3.Co-IP结果显示FBXO31能与Snail1相互结合，且F-box结构域对于二者的相互作用是必需的，体内泛素化实验结果表明FBXO31能引起Snail1的泛素化，进一步研究发现FBXO31与Snail1的相互作用依赖于Snail1的磷酸化。
　　2.动物水平的研究
　　动物实验表明高表达的FBXO31能显著抑制裸鼠体内胃癌细胞的侵袭转移。
　　3.临床标本的研究
　　Western blot结果显示:与癌旁组织相比，胃癌组织中FBXO31显著低表达，而Snail1显著高表达，二者在胃癌组织中的表达呈显著负相关。
　　实验结论:
　　研究结果表明，FBXO31能够泛素化降解EMT相关转录因子Snail1，进而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。在二者的相互作用中，FBXO31的F-box结构域和Snail1的GSK-3β磷酸化基序是不可或缺的。该研究阐明了FBXO31抑制胃癌进展的分子机制，并确定了EMT转录因子Snail1作为FBXO31调节胃癌侵袭转移的新靶点，为以FBXO31途径为靶点的抗肿瘤治疗提供理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

(一)肿瘤的侵袭转移是导致癌症患者死亡的重要原因，EMT在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用

(二)泛素-蛋白酶体降解系统是调节EMT-TFs稳定性的主要途径

(三)F-box蛋白FBXO31参与SCF E3泛素连接酶的组成，是胃癌中的肿瘤抑制因子，但其抑制胃癌进展的机制有待阐明

实验材料

1．细胞系

2．细胞培养

3．细胞转染

4．组织或细胞总RNA提取

5．PCR试剂

6．琼脂糖凝胶电泳

7．组织或细胞中总蛋白的提取及含量测定

8．Western Blot实验

9．分子克隆实验

10．免疫共沉淀实验

11．裸鼠

12．临床标本

13．其他试剂

14．主要仪器

实验方法

1．细胞培养

2．细胞转染

3．RNA含量测定

4．Western Blot

5．细菌转化

6．质粒提取

7．胶回收

8．分子克隆

9．免疫共沉淀

10．细胞划痕实验

11．Transwell

12．慢病毒筛选稳定细胞株

13．裸鼠体内侵袭转移实验

14．数据分析

实验结果

二、FBXO31下调EMT相关转录因子Snail1蛋白的表达

三、FBXO31促进Snail1通过泛素蛋白酶体途径降解

四、FBXO31促进胃癌细胞在裸鼠体内的侵袭转移

五、胃癌组织标本中FBXO31与Snail1蛋白表达呈负相关

讨论

附图表

参考文献

致谢

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