稀土对临床分离株MRSA·NMGY3抗药性的影响及其机理研究

摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是全球性的最重要的耐药致病菌之一,而抗耐药性金葡菌的药物研发一直是个热点,受到各国学者关注。研究稀土类药物对MRSA的抑菌性,探讨其抑菌机理,将有助于寻找高效、低毒的新药,对临床医药的发展具有一定的意义,同时为耐药机制研究提供一些的理论基础。对稀土的生物效应的理论研究也具有一定的意义。本课题采用抑菌圈实验方法测定了稀土离子对MRSA·NMGY3的抑菌性;采用克隆、测序等方法研究稀土对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株MRSANMGY3编码青霉素结合蛋白(PBP2a)转肽酶区的MecA基因片段的影响;采用扫描电镜、紫外、红外、氨基酸含量测定和1H-NMR等测试手段,研究稀土对临床分离株MRSANMGY3细胞壁的直接作用。实验结果如下:(1)依据《全国临床检验操作规程》判定标准,MRSA·NMGY3临床分离株对青霉素类抗生素具有耐药性。(2)当大于5×10-2mol/ml的稀土Nd3+对MRSA·NMGY3菌株才具有抑菌性,而小于5×10-3mol/ml的Nd3+对MRSA·NMGY3菌株没有抑菌性。(3)稀土Nd3+与青霉素混合液对MRSA·NMGY3的抑菌性较单一青霉素液明显下降。(4)经稀土培养后的MRSA·NMGY3对青霉素的耐药性下降。(5)低浓度5×10-6M稀土下对MRSA·NMGY3菌株的生长状态具有促进作用,而在大于5×10-5M等较高浓度下对MRSA·NMGY3菌株的生长表现出明显抑菌活性,浓度越大,抑菌作用越强。(6)在培养基中加入稀土La3+、Gd3+和Nd3+离子后,MRSA·NMGY3菌株的编码PBP2a转肽酶区的MecA基因序列没有变化。(7)菌株MRSA·NMGY3的MecA基因测序结果与基因库中BB270菌株序列进行比对,发现有3个碱基不同,1715位的A→C,1829-1830位的GT→CA。据此推测PBP2a转肽酶肽链的一级结构氨基酸序列中相应有两个氨基酸不同,分别是天冬酰胺(Asn)变为苏氨酸(Thr),丝氨酸(Ser)变为苏氨酸(Thr)。(8)扫描电镜观察发现经1×10-3mol/L稀土Nd3+处理1h后的MRSA·NMGY3细胞破损,胞内容物溢出,细胞个体之间相互堆积的成团;(9)紫外和红外光谱说明稀土Nd3+对细胞壁的肽聚糖的立体结构有一定的破坏,少部分键断裂,导致网孔增大,细胞壁透性变大,细胞壁被破坏;(10)氨基酸的检测结果显示部分氨基酸含量增加;(11)核磁共振(1H-NMR)检测结果显示稀土对细胞壁的结构改变较明显。依据实验结果得出如下结论:(1)稀土Nd3+对MRSA·NMGY3菌株具有抑菌作用,稀土Nd3+不能与青霉素混合使用,稀土能减弱MRSA·NMGY3对青霉素的抗药性。(2)稀土对MRSA·NMGY3菌株的生长具有影响,低浓度具有促进作用,高浓度表现出明显抑菌活性,浓度越大,抑菌作用越强。(3)稀土离子La、Gd和Nd对MRSA·NMGY3编码PBP2a转肽酶区的MecA基因没有影响。(4)临床分离株MRSA·NMGY3的MecA基因序列与基因库中BB270菌株序列不同,是变异株。(5)扫描电镜、紫外、红外、氨基酸含量测定和1H-NMR等测试结果说明了稀土对MRSA·NMGY3细胞壁具有直接破坏作用。

目录

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌概述

1.1.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的发现

1.1.2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制

1.1.3 抗金葡菌药物研究现状

1.2 稀土的应用

1.3 稀土对生物体的作用

1.3.1 稀土对细胞壁和细胞膜系统的作用

1.3.2 稀土对酶的作用

1.3.3 稀土对遗传物质DNA 的作用

1.4 稀土药物的发展

1.5 研究内容和意义

1.5.1 研究内容

1.5.2 研究意义

第二章 实验仪器及药品

2.1 实验仪器

2.2 实验材料

2.2.1 实验药品

2.2.2 培养基

2.2.3 实验用菌株

第三章 药敏试验

3.1 MRSA·NMGY3 菌株的药敏试验

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.1.3 实验方法

3.1.4 实验结果与分析

3.2 稀土 Nd~(3+)对菌株MRSA·NMGY3 的抑菌性

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验仪器

3.2.3 实验方法

3.2.4 实验结果与分析

3.3 Nd~(3+)与青霉素钠混合液对菌株MRSA·NMGY3 药敏实验

3.3.1 实验材料

3.3.2 实验仪器

3.3.3 实验方法

3.3.4 实验结果与分析

3.4 稀土 Nd~(3+)预处理菌株MRSA·NMGY3 后的药敏实验

3.4.1 实验材料

3.4.2 实验仪器

3.4.3 实验方法

3.4.4 实验结果与分析

3.5 本章小结

第四章 稀土离子对MRSA·NMGY3 编码PBP2a MecA 基因的影响

4.1 MRSA·NMGY3 的稀土离子预处理

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验方法

4.1.4 实验结果与分析

4.2 耐药菌 MRSA·NMGY3 基因组 DNA 的提取

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验仪器

4.2.3 实验方法

4.2.4 实验结果与分析

4.3 目的片段的扩增

4.3.1 实验材料

4.3.2 实验仪器

4.3.3 实验方法

4.3.4 实验结果与分析

4.4 PCR 产物的胶回收、连接与转化

4.4.1 实验材料

4.4.2 实验仪器

4.4.3 实验方法

4.4.4 实验结果与分析

4.5 筛选阳性克隆子

4.5.1 实验材料

4.5.2 实验仪器

4.5.3 实验方法

4.5.4 实验结果与分析

4.6 目的片段的测序与比对

4.6.1 实验材料

4.6.2 实验仪器

4.6.3 实验方法

4.6.4 实验结果与分析

4.7 本章小结

第五章 稀土离子对 MRSA·NMGY3 细胞壁的直接影响

5.1 MRSA·NMGY3 菌种的收集与稀土Nd~(3+)处理后的镜检

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验仪器

5.1.3 实验方法

5.1.4 实验结果

5.2 扫描电镜分析

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验仪器

5.2.3 实验方法

5.2.4 实验结果

5.3 经稀土Nd~(3+)处理的 MRSA·NMGY3 菌体细胞壁的提取

5.3.1 实验材料

5.3.2 实验仪器

5.3.3 实验方法

5.3.4 实验结果

5.4 细胞壁紫外光谱分析

5.4.1 实验材料

5.4.2 实验仪器

5.4.3 实验方法

5.4.4 实验结果

5.5 细胞壁傅立叶红外光谱分析

5.5.1 实验材料

5.5.2 实验仪器

5.5.3 实验方法

5.5.4 实验结果

5.6 细胞壁氨基酸检测分析

5.6.1 实验材料

5.6.2 实验仪器

5.6.3 实验方法

5.6.4 实验结果

5.7 细胞壁核磁共振检测

5.7.1 实验材料

5.7.2 实验仪器

5.7.3 实验方法

5.7.4 实验结果

5.8 本章小结

第六章 结论

参考文献

致谢

个人简介