转运蛋白HPO497参与调控幽门螺杆菌适应克拉霉素压力

摘要

目的:
　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种螺旋状的微需氧革兰氏阴性细菌，生存于人类的胃粘膜表面，是目前唯——种定殖于人胃部的病原菌。幽门螺杆菌的感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因，并与胃癌、胃黏膜相关淋巴组织(MLAT)淋巴瘤的发生密切相关。世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为第一类致癌因子，是胃癌的危险因素。目前，全球约一半的人口已感染幽门螺杆菌。所以，幽门螺杆菌的清除和感染治疗是防治胃癌的有效手段。
　　如今，国际上清除幽门螺杆菌的通用方法是三联疗法，即，使用胶体铋剂或质子泵抑制剂，并同时并用两种抗生素。常用的抗生素有:以克拉霉素为代表的大环内酯类抗生素;以甲硝唑为代表的硝基咪唑类抗生素;以阿莫西林为代表的β-内酰胺类抗生素等。
　　克拉霉素是新一代大环内酯类抗生素，它在胃酸中表现稳定，而且易于人体吸收，进而成为了治疗幽门螺杆菌感染的最常用抗生素之一。然而，由于近年来国际上对抗生素的过量使用，使得细菌对抗生素的获得性耐药成为了引起幽门螺杆菌清除失败的主要原因。尤其是克拉霉素的耐药率，在国内外均处于上升趋势。克拉霉素作用于核糖体大亚基上的23S rRNA，从而抑制蛋白质的合成而产生抑菌效果。所以目前，国际上对克拉霉素耐药机制的研究主要集中在23S rRNA位点的点突变上。然而，也有一些研究表明，在一些克拉霉素的坳耐药株中，该点突变并不是造成克拉霉素耐药的唯一因素
　　近些年来大量研究发现，对药物吸收降低和药物外排增加的机制也是细菌内在耐药机制中的重要部分。目前已发现三种RND家族的外排泵系统存在于幽门螺杆菌中参与幽门螺杆菌的耐药压力，分别是hefABC, hefDEF,和hefGHI基因。除了外排泵系统，在转运蛋白中还有大量的包括吸收系统在内的各种转运蛋白系统，在细菌中行使着不同的转运功能，它们是否参与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药过程仍未有研究报导。
　　我们通过实时定量PCR筛选出在克拉霉素压力下的野生株和克拉霉素耐药株中表达有变化的转运蛋白基因HP0497，进而采用多种研究方法探讨该基因在克拉霉素耐药过程中的作用。
　　本实验研究主要目的在于，证实转运蛋白HP0497参与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药作用和其内在机制，并且还可能参与幽门螺杆菌的多耐药特性。这为解决幽门螺杆菌乃至其他致病菌的多耐药问题提供了新的思路，帮助找到新的药物作用靶点，同时，也为抗生素在临床的合理使用提供了有效指导。
　　方法:
　　1、使用克拉霉素处理野生株Hp26695，提取mRNA，逆转录出cDNA后，进行qPCR，检测出具有表达差异的转运蛋白基因。将检测出来的基因在克拉霉素耐药株中筛查，用qPCR法找出同时具有表达差异的基因。
　　2、以野生株Hp26695为亲本构建基因敲除株△HP0497，以克拉霉素耐药株为亲本构建基因敲除株△HP0497-a。
　　3、测定野生株Hp26695和△HP0497的生长曲线。
　　4、测定野生株Hp26695和△HP0497对克拉霉素的生长抑制曲线。
　　5、测定野生株Hp26695、△HP0497和△HP0497-a对克拉霉素的最小抑菌浓度。
　　6、激光共聚焦显微镜比较经荧光标记的克拉霉素处理前后的野生株Hp26695和△HP0497存活率。
　　7、测定野生株Hp26695、△HP0497和克拉霉素耐药株在荧光积累试验中荧光染料H33342的残留量。
　　8、测定转运蛋白HP0497在克拉霉素临床耐药株和敏感株中的表达情况。
　　9、在野生株Hp26695和△HP0497中测定外排泵系统基因(hefABC, hefGHI)的表达量变化。
　　结果:
　　1、转运蛋白HP0497在经克拉霉素处理的幽门螺杆菌野生株Hp26695中表达显著升高，在克拉霉素耐药株（实验室诱导株）中表达也升高，预测转运蛋白HP0497可能参与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药机制。
　　2、成功构建出以幽门螺杆菌野生株Hp26695为亲本的基因敲除株△HP0497，以幽门螺杆菌克拉霉素耐药株为亲本的基因敲除株△HP0497-a。
　　3、对比△HP0497与WT Hp26695的生长曲线，结果显示敲除HP0497后不影响幽门螺杆菌的生长活力。
　　4、对比△HP0497与WT Hp26695的对克拉霉素的杀菌曲线、最小抑菌浓度、激光共聚焦图片，表明敲除了HP0497后幽门螺杆菌对克拉霉素的敏感性显著升高。
　　5、对比△HP0497与WT Hp26695的荧光染料积累量，结果显示敲除HP0497后幽门螺杆菌中染料H33342的积累量显著升高。
　　6、对比临床克拉霉素耐药株和敏感株中转运蛋白HP0497的表达情况，结果显示其在耐药株的表达明显高于敏感株。
　　7、对比△HP0497与WTHp26695中外排泵系统(hefABC, hefGHI)的表达情况，结果显示敲除HP0497后，两种外排系统表达显著降低。
　　结论:
　　转运蛋白HP0497在幽门螺杆菌对克拉霉素适应的过程中起着重要作用，能够通过一定的机制影响下游外排泵(hefABC, hefGH)的表达，有效排出克拉霉素，使得幽门螺杆菌在克拉霉素压力下能减少损害，迅速适应压力环境，为幽门螺杆菌的耐药的产生提供了时间和物质基础。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．1 菌株

1．2 培养基

1．3 质粒及引物

1．4 试剂及配制

1．5 实验仪器

2 实验方法

2．1 细菌培养

2．2 细菌最小抑菌浓度测定(MIC)

2．3 细菌基因相对表达水平测定

2．4 基因敲除株的构建

2．5 生长曲线和生长抑制曲线

2．6 荧光染色试验

2．7 荧光积累试验

2．8 统计学分析

结果

3 ΔHP0497突变株的验证

4 转运蛋白HP0497参与幽门螺杆菌适应克拉霉素压力

4．1 细菌生长力测试

4．2 生长抑制曲线

4．3 荧光染色试验

4．4 对克拉霉素的最小抑菌浓度(MIC)

5 荧光染料外排试验

6 转运蛋白HP0497影响外排泵系统HefABC、HefGHI参与幽门螺杆菌适应克拉霉素压力

7 多种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章