HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生的抑制作用及机制研究

摘要

研究目的
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种嗜肝DNA病毒，全球约有4亿HBV携带者，HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎，并与肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生密切相关。HBV被认为是一种“隐匿性病毒”，在感染早期能够逃避机体免疫监视，HBV可产生多种病毒相关蛋白以抑制机体天然和适应性抗病毒免疫应答，导致病毒在体内长期存在。
　　NLRP3炎症小体(inflammasome)是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合体，能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号，促进IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和释放。NLRP3炎症小体的活化需要双信号:第一信号（预刺激信号）由病原相关分子模式(Pathogen-associated molecularpattern，PAMP)诱导产生，通过活化NF-κB信号通路而促进NLRP3和pro-IL-1β的表达;第二信号（活化信号）由危险相关分子模式(Damage-associated molecularpatterns，DAMP)诱导产生，通过活化caspase-1促进IL-1β等细胞因子的成熟和分泌。IL-1β作为一种多效炎症因子，能够促进多种免疫相关基因的表达，并募集淋巴细胞至感染部位，抑制包括HBV在内的多种病原微生物感染。研究表明，多种病原微生物可通过各种机制抑制NLRP3炎症小体的活化，进而逃逸机体的免疫应答。但是HBV感染与NLRP3炎症小体活化之间的关系尚不清楚。
　　肝脏是人体最重要的代谢和解毒器官，来自肠道中的细菌成分（如LPS）可通过门静脉进入肝脏，导致肝脏中NLRP3炎症小体的活化和促炎因子的产生，而肝脏又是HBV的主要感染器官，那么HBV能否通过影响肝内NLRP3炎症小体的活化而促进自身的免疫逃逸？为了探讨这一问题，在本研究中，我们首先利用HBV体内外感染模型证实HBV自身并不能活化NLRP3炎症小体;进而通过给予LPS诱导肝组织中NLRP3炎症小体的活化，发现肝脏Kupffer细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞，而HBV感染可明显抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化;继而利用体外细胞模型、HBeAg突变小鼠模型和临床HBV慢性感染及肝癌患者标本证实HBV分泌的HBeAg介导了对NLRP3炎症小体活化的抑制作用，并深入探究了其作用机制;最后，在鼠伤寒感染模型中进一步验证了HBV对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。
　　研究方法
　　1.通过Real-time PCR和Westem blotting技术检测HBV稳定表达细胞系、HBV感染小鼠及临床HBV患者肝组织中NLRP3炎症小体及活化相关分子的表达。
　　2.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2或pAAV/HBV1.2-e-null质粒至C57BL/6小鼠体内，建立HBV感染小鼠模型或HBV-e-null小鼠模型。
　　3.通过ELISA检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平;通过免疫组化检测肝组织原位HBcAg表达;通过荧光定量PCR检测HBV DNA含量。
　　4.通过流式细胞术和免疫荧光技术检测Kupffer细胞中IL-1β的表达。
　　5.通过流式细胞术和Westem blotting检测细胞中NF-κB的活化。
　　6.利用ZDOCK3.0.2程序对HBeAg与TRAM、MAL分子进行模拟对接。
　　7.通过ELISA检测细胞培养上清、血清或肝脏研磨液中IL-1β、IL-18和IL-6的水平。
　　8.通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测DCF的荧光强度以检测ROS产生。
　　9.通过Western blotting检测细胞膜上p47-phox和Na+/K+ ATPase的表达。
　　10.通过激光共聚焦显微镜分别观察胞浆中Fluo-3/AM和溶酶体中LysoTracker的荧光强度以检测细胞中Ca2+水平和溶酶体稳定性。
　　11.用鼠伤寒沙门氏菌分别感染HBV慢性感染小鼠和对照小鼠后，通过检测肝脏组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量和小鼠生存期，以确定小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。
　　实验结果
　　1.HBV感染不能活化NLRP3炎症小体
　　HepG2.2.15细胞中NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β等NLRP3炎症小体相关分子的表达水平显著低于HepG2细胞;体外用LPS和不同浓度的HBV颗粒刺激分化后的THP-1细胞不能活化NLRP3炎症小体;与对照小鼠相比，急性和慢性HBV感染小鼠的肝组织中NLRP3炎症小体相关成分及血清中IL-1β表达均未见明显升高。
　　2.HBV能够抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化
　　HBV慢性感染可显著抑制LPS诱导的小鼠肝组织中NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;肝脏中的巨噬细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞，并且HBV主要抑制小鼠肝脏Kupffer细胞中IL-1β的表达;用含HBV成分的培养上清孵育分化的THP-1细胞能够显著抑制细胞中LPS诱导的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。以上结果说明，HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化有抑制作用。
　　3.HBeAg，而非HBsAg，具有抑制NLRP3炎症小体活化的作用
　　HBeAg预孵育可显著抑制LPS诱导的THP-1细胞中的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;体内实验显示，HBV慢性感染可显著抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体活化，但是在HBeAg缺失的HBV慢性感染小鼠中，HBV对炎症小体的抑制作用减弱;HBeAg不但可以抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化，还能抑制其它活化剂诱导的该炎症小体的活化。HBsAg预孵育与否并不影响LPS诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活化。以上结果说明，对NLRP3炎症小体发挥抑制作用的是HBeAg，而不是HBsAg。
　　4.HBeAg通过抑制NF-κB的活化抑制NLRP3和pro-IL-1β的表达
　　HBeAg预孵育分化的THP-1细胞，可显著抑制LPS诱导的NF-κB的活化水平和下游细胞因子IL-6和TNF-α的表达。利用ZDOCK3.0.2程序对HBeAg和NF-κB信号通路下游的两个接头分子TRAM和MAL进行模拟对接，发现HBeAg和这两个分子均存在结合区域。说明HBeAg有可能通过与TRAM和MAL分子结合而抑制NF-κB的活化。
　　5.HBeAg通过抑制ROS产生抑制NLRP3炎症小体的活化
　　HBeAg预孵育分化的THP-1细胞，可显著抑制LPS诱导的NADPH氧化酶的活化，进而抑制ROS的产生;外加H2O2后，HBeAg对NLRP3炎症小体的抑制作用明显降低。
　　6.HBeAg+的临床HCC和CHB患者体内NLRP3炎症小体的活化被抑制
　　HBeAg+的HCC患者癌旁组织NLRP3、活化的caspase-1 p20、pro-IL-1β和成熟的IL-1β p17的表达水平显著低于HBeAg-患者。同样，HBeAg+的HCC患者肝组织Kupffer细胞中IL-1β水平明显低于HBeAg-患者。
　　免疫耐受期(HBeAg+) CHB患者血清IL-1β水平较低，而部分免疫非活化期(HBeAg)患者血清IL-1β水平较高。除HBeAg外尚有其它因素对炎症小体的活化和IL-1β的表达产生影响。
　　7.HBV慢性感染小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染更加敏感
　　与对照小鼠相比，HBV慢性感染小鼠在感染鼠伤寒沙门氏菌后，体内NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌更低，肝组织的细菌载量更高，生存期更短。说明HBV可能通过降低NLRP3炎症小体的活化和IL-1β的表达增加小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。
　　结论及意义
　　1.本研究发现Kupffer细胞是肝脏中表达NLRP3炎症小体和产生IL-1β的主要细胞。
　　2.本研究首次发现HBV本身不能活化NLRP3炎症小体，但可以通过HBeAg抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化和IL-1β等促炎因子的产生，从而抑制机体的抗病毒免疫应答，有利于HBV在体内的存活和慢性感染状态的形成。
　　3.本研究首次阐明HBeAg抑制NLRP3炎症小体的两个途径:既通过抑制NF-κB信号通路抑制NLRP3和pro-IL-1β分子的表达，又通过抑制ROS抑制caspase-1的活化和IL-1β的成熟。
　　4.本研究首次发现HBV可通过抑制肝脏NLRP3炎症小体活化而抑制炎症反应并阐明了其主要分子机制，揭示了HBV免疫逃逸的一种新方式，为治疗HBV慢性感染及相关疾病提供新的策略。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一部分 文献综述

一、HBV慢性感染与免疫逃逸

1 HBV基因组及编码蛋白

2 HBV免疫逃逸机制

3 总结和展望

二、炎症小体与肝脏疾病

1 炎症小体

2 炎症小体在肝脏不同细胞中的表达

3 炎症小体在肝脏疾病中的作用

4 总结与展望

1 宿主对炎症小体的负调控

2 病毒对炎症小体信号通路的负调控

3 细菌对炎症小体的抑制作用

4 总结与展望

参考文献

第二部分 HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生的抑制作用及机制研究

前言

1 主要实验材料和试剂

2 主要试剂配置

3 主要仪器设备

4 主要实验方法

实验结果

1 确定HBV感染能否活化NLRP3炎症小体

2 HBV能够抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化

3 HBeAg能够抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化

4 HBsAg不能抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化

5 HBeAg通过抑制NF-κB信号通路抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化

6 HBeAg通过抑制ROS的产生抑制NLRP3炎症小体的活化

7 HBeAg+的CHB和HCC病人低表达IL-1β和NLRP3炎症小体相关分子

8 HBV感染增加小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性

讨论

参考文献

小结

论文创新性和意义

致谢

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