血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤中NR4A3基因5’UTR区域甲基化状态的研究

摘要

背景：
　　血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma，AITL)是外周T细胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma，PTCL)的一种常见亚型。AITL的起因和机理的研究还不明确，而且对于其治疗仍未达到共识。对于AITL的形成，遗传学和表观遗传学机制都对AITL形成和发展起到了作用。基因NR4A3属于NR4A家族，参与细胞周期、凋亡、炎症、代谢等过程。现在已经有证实在许多肿瘤中起到抑制作用，特别是在血液系统肿瘤中。本实验主要研究基因NR4A3的5'UTR区域甲基化在血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤中的发生情况。目的是为血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤寻找生物学标记物，帮助诊断。
　　方法：
　　(1)研究对象为2005.01年-2014.11年共60例血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和对照组淋巴结反应性增生50例，收集石蜡包埋的病理组织，切片并对组织进行DNA提取。
　　(2)选取肿瘤与增生组织共10例，为得到甲基化程度不同，使用Illumina甲基化基因芯片分析。并对芯片结果按照基因注释、CpG注释分类，进行GO和KEGG分析。
　　(3)根据芯片结果筛选抑癌基因，对筛选出来的基因用甲基化特异性PCR(MSP)在大样本中验证，对DNA甲基化定性检测。在检测的基因中找到甲基化发生率差别最大的基因。
　　(4)对82例样本（包括肿瘤53例和增生29例）进行甲基化定量检测。使用的是焦磷酸测序技术。
　　(5)亚硫酸氢盐测序(BSP)方法被用来对T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株进行甲基化程度分析。
　　(6)收集随访成功病例的相关临床参数及各项指标如患者性别、年龄、肿瘤大小、ki67、LDH，甲基化、对患者生存情况进行随访。对以上因素进行统计学分析，制作生存曲线。
　　结果：
　　(1)Illumina芯片提示我们基因body以外区域异常的甲基化发生于promoter区和5'UTR区的频率较高。异常甲基化多见于CpG shore区域和岛内。KEGG和GO分析，得到存在差异基因较多的信号通路和生物学功能。得到甲基化差异显著的基因。
　　(2)对芯片结果提示的甲基化差异显著的抑癌基因sept9、CCDC67、BCL2L10、BBC3、NEIL1、P21和NR4A3使用MSP对其芯片提示位点的甲基化进行检测，结果显示NR4A3在AITL中甲基化发生率较高，在增生组中相对发生率低，差异有统计学意义(P=0.00)。其他基因并没有发现明显的差异。
　　(3)对NR4A3基因5'UTR区域上芯片提示位点焦磷酸测序结果表明，与对照组相比NR4A3的5'UTR区域的四个CpG位点均在AITL中发生高甲基化(P＜0.05)。
　　(4) BSP结果说明在大于或等于50％的甲基化程度出现在T淋巴细胞白血病jurkat细胞系中NR4A3在5'UTR区域的四个位点上，但在promoter区域没有明显的高甲基化。
　　(5)统计学结果表明，在上述的这些因素中，年龄、性别、肿瘤大小、Ki67、NR4A3甲基化情况跟生存期并没有相关性，LDH升高倾向于更少的总体生存时间(overall survival, OS)(P＜0.05)。
　　结论：
　　在AITL中，异常甲基化发生频率较高。除了基因的body区域，异常甲基化常发生于promoter和5'UTR区域。甲基化差异基因主要富集在合成代谢、发育、分化、胚胎形成形态发生、神经突触、调节激酶活性、跨膜转运等生物学功能。kegg富集得到MARK、肿瘤信号通路，钙信号通路、癌症转录失调、Akt通路、Ras等通路。超甲基化发生于基因NR4A3的5'非编码区。其5'非编码区的异常高甲基化将会有可能成为帮助AITL诊断的新的肿瘤生物学标志物。另外，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤中LDH升高倾向于不良预后。

目录

声明

摘要

中英文缩写词对照表

前言

1．血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤

2．DNA甲基化

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法与步骤

实验结果

1．AITL与非肿瘤组织的全基因组DNA甲基化表型

2．MSP检测石蜡样本甲基化

3．焦磷酸测序检测石蜡样本

4．对Jurkat细胞系BSP检测甲基化程度

5．AITL患者生存率情况及生存分析

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间所发表论文