苔类植物多酚及萜类化合物生物合成途径相关基因的克隆与功能研究

摘要

苔藓植物在植物界中介于藻类与蕨类植物之间，是仅次于种子植物的第二大植物种群，在自然界中分布广泛。苔类植物富含大量的次生代谢产物，主要是萜类以及多酚类化合物，化学结构复杂多样，具有抗肿瘤、抗真菌、抗氧化以及昆虫拒食等广泛的生物活性。但是由于苔藓植物本身个体较小以及生长环境复杂多样，对其进行采集困难重重，对其中分离得到的活性较好的化合物，在短期内难以进行大量的富集，用于进一步的研究，这极大地限制了新药研发的步伐。随着生物技术的不断进步，代谢工程以及合成生物学的应用，为解决该问题提供了一个途径。苔类植物中富含大量比较独特的的双联苄类化合物以及特殊结构的萜类化合物，然而对于其生物合成反应催化的关键酶研究还比较少，因此，探寻苔类植物中催化产生次级代谢产物的关键酶，阐明一些重要次级代谢产物的生物合成途径，通过组合生物合成的方法得到目标化合物或者通过基因改造的手段来提高目标化合物的产量，已经成为解决活性化合物来源的一个重要途径。
　　本文通过从几种苔类植物转录组测序以及cDNA文库中，筛选出了几个与萜类以及多酚类生物合成相关的基因进行研究。包括二萜合酶(diTPS)，从萜类含量丰富的蛇苔中克隆获得两个二萜合酶，并对其功能进行了初步的研究;酚酸脱羧酶(PAD)，从小蛇苔中克隆得到了一个PAD基因，对其体外功能以及基因定位进行了研究;对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)，从钝鳞紫背苔以及粗裂地钱中总共克隆得到了7个4CL基因，对其体外功能以及非生物胁迫下表达量随时间的变化关系进行了研究，同时挑选了活性较好的两个基因转入拟南芥中，对转基因植株中黄酮以及木质素的含量进行了分析，对其在植物体内的功能进行了研究。主要的研究内容以及结果如下:
　　1.蛇苔中二萜合酶基因的克隆和功能研究
　　本文从蛇苔(Conocephalumconicum)的转录组数据库中筛选到两个二萜合酶，通过NCBI数据库进行分析发现，他们分别注释为焦磷酸古巴酯合酶(CPS)以及对映贝壳杉烯合酶(KS)，分别命名为CcCPS和CcSS。CcCPS与拟南芥的AtCPS以及小立碗藓的PpCPS/KS具有较高同源性，而且都能够找到CPSs保守的功能域DXDD，属于ClassⅡ型二萜合酶。CcSS具有保守的功能域DDXXD，属于ClassⅠ型二萜合酶。对其进行进化地位分析，发现CcCPS和CcSS都与已报道的其他三种苔藓植物的二萜合酶归为一簇。将它们N端的转运肽去掉，并构建到原核表达载体上，在大肠杆菌中进行表达，得到重组蛋白。以焦磷酸香叶基香叶酯(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)为底物，对目的蛋白进行体外酶活测定，结果表明，CcCPS能够催化GGPP生成对映-柯杷酰焦磷酸(ent-CPP)，CcSS则催化ent-CPP生成对映海松烷型二萜(ent-sandaracopimaradiene)以及对映贝壳杉烷型二萜(ent-kaurene)两种不同结构类型的二萜化合物，其中以对映海松烷型二萜化合物为主要的酶活产物。
　　2.苔类植物中对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)基因的克隆和功能研究
　　4CL是苯丙烷代谢途径上的第三个酶，也是调控苯丙烷代谢途径方向的关键酶。本文从苔类植物cDNA文库以及转录组测序中，发现几个注释为对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)的序列，将其进行克隆得到全长。其中钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)中有3个，分别命名为Pa4CL1-3;粗裂地钱(Marchantiapaleacea)中克隆得到4个基因，命名为Mp4CL1-4。
　　将这些基因分别构建到大肠杆菌中进行蛋白表达，得到重组蛋白，并进行体外酶活反应，测定其功能。研究发现Pa4CL1、Pa4CL2、Mp4CL1以及Mp4CL2都能够以对羟基肉桂酸为最佳底物，生成对羟基肉桂酰辅酶A，同时能够催化二氢对羟基肉桂酸生成双联苄类化合物的前体dihydro-p-coumaryol-CoA，但是其催化活性以及底物的选择性有所差异，Pa4CL3以及Mp4CL3、Mp4CL4则没有检测到催化活性。同时为了探究关键氨基酸对底物选择性以及活性的影响，我们对Pa4CL1进行了点突变，发现氨基酸Met-247以及Ala-251参与底物的催化，与蛋白对底物的结合能力有关，跟底物的选择性没有必然关系。
　　将Pa4CL2以及Mp4CL1转入模式植物拟南芥中，对转基因植株中木质素以及黄酮类化合物的含量进行了测定，发现Pa4CL2以及Mp4CL1转基因拟南芥植株中木质素的含量明显增加，黄酮类化合物的含量则有所减少。对Pa4CL1以及Mp4CL1用茉莉酸甲酯、水杨酸以及脱落酸等进行处理，发现它们的表达量受到非生物胁迫因子的诱导。Pa4CL1、Pa4CL2、Mp4CL1以及Mp4CL2定位在细胞质以及细胞核中。
　　3.小蛇苔中酚酸脱羧酶(PAD)基因的克隆和功能鉴定
　　本文从小蛇苔(Conocephalumjaponicum)的转录组测序结果中，发现了一个与微生物中酚酸脱羧酶同源性较高的序列，将其克隆并命名为CjPAD，这是首次从植物当中克隆得到的酚酸脱羧酶基因。该基因序列长度大约是微生物酚酸脱羧酶基因序列的二倍，同时具有4个酚酸脱羧酶保守的催化位点:Tyr-60，Tyr-62，Arg-90以及Glu-114。为了进一步研究其功能，我们将该基因分别在N端和C端进行了截短，并与原长序列一起分别构建到原核表达载体上，在大肠杆菌中进行蛋白表达得到了相应的重组蛋白。以酚酸类化合物为底物对其进行了体外酶活功能研究，发现CjPAD能够催化对羟基肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸以及芥子酸等，生成相应的乙烯基化合物，截短后的蛋白则失去了活性，不能够催化这些酚酸化合物。同时构建了全长GFP-GjPAD和N端截短的GFP-GjPAD-Tr定位表达载体，将其分别在烟草叶片中进行定位观察，发现都同时定位在细胞质和细胞核中，说明CjPAD的N端不具备转运信号肽，对于基因定位不具备关键作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 萜类化合物次级代谢途径研究

1．2．1 焦磷酸香叶酯合酶

1．2．2 单萜合酶

1．2．3 法呢基焦磷酸合酶

1．2．4 倍半萜合酶

1．2．5 焦磷酸香叶基香叶酯合酶

1．2．6 二萜合酶

1．3 多酚类化合物的次级代谢途径研究

1．3．1 苯丙氨酸裂解酶

1．3．2 肉桂酸-4-羟化酶

1．3．3 对羟基肉桂酰辅酶A连接酶

1．3．4 酚酸脱羧酶

1．4 本论文立题依据和研究内容

参考文献

第二章 蛇苔二萜合酶的克隆和功能研究

2．1 引言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 植物材料

2．2．2 质粒与菌株

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要溶液和培养基

2．2．5 实验设备

2．2．6 引物序列

2．3 实验方法

2．3．1 蛇苔二萜合酶基因的克隆

2．3．2 蛇苔二萜合酶原核表达载体的构建

2．3．3 蛇苔二萜合酶蛋白表达与纯化

2．3．4 蛇苔二萜合酶体外功能鉴定

2．3．5 进化地位分析

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 蛇苔二萜合酶基因克隆与序列分析

2．4．2 蛇苔二萜合酶的表达及纯化

2．4．3 蛇苔二萜合酶体外功能研究

2．5 本章小结

参考文献

第三章 苔类植物对羟基肉桂酰辅酶A连接酶的克隆和功能研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 植物材料与菌株

3．2．2 其他材料与试剂

3．2．3 本章引物序列

3．2．4 4CL基因的克隆

3．2．5 蛋白表达

3．2．6 Pa4CL1突变体的构建及表达

3．2．7 体外酶活功能鉴定

3．2．8 进化地位分析与同源模拟

3．2．9 目的基因在烟草中的定位

3．2．10 目的基因在拟南芥中的过表达

3．2．11 转基因拟南芥中黄酮类化合物含量分析

3．2．12 转基因拟南芥中木质素含量分析

3．2．13 非生物胁迫因子诱导

3．3 实验结果

3．3．1 4CL基因克隆

3．3．2 序列分析及同源模拟

3．3．3 4CL蛋白表达

3．3．4 Pa4CL1突变体的构建及表达

3．3．5 4CL酶学性质研究

3．3．6 4CL在烟草中的定位

3．3．7 4CL在拟南芥中的过表达

3．3．8 转基因拟南芥中黄酮类化合物含量分析

3．3．9 转基因拟南芥中木质素含量分析

3．3．10 4CL对非生物胁迫因子应答

3．4 本章小结

参考文献

第四章 小蛇苔中酚酸脱羧酶的克隆和功能鉴定

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 植物材料

4．2．2 质粒与菌株

4．2．3 主要试剂

4．2．4 引物序列

4．2．5 实验设备

4．3 实验方法

4．3．1 小蛇苔酚酸脱羧酶基因克隆

4．3．2 小蛇苔酚酸脱羧酶原核表达载体的构建

4．3．3 小蛇苔酚酸脱羧酶蛋白表达与纯化

4．3．4 小蛇苔酚酸脱羧酶体外功能鉴定

4．3．5 小蛇苔酚酸脱羧酶基因定位

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 小蛇苔CjPAD基因克隆与序列分析

4．4．2 CjPAD原核表达载体的构建

4．4．3 CjPAD蛋白表达

4．4．4 CjPAD的功能鉴定

4．4．5 CjPAD的亚细胞定位分析

4．5 本章小结

参考文献

致谢

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