α5-nAChR/STAT3反馈调节环路在尼古丁促非小细胞肺癌细胞增殖中的作用及机制

摘要

[背景]
　　肺癌是一种常见的肺部恶性疾病，其发病率和死亡率均居癌症之首，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌类型85％以上。吸烟是诱发肺癌发生、发展的重要环境因素之一。烟草中最重要的成瘾成分尼古丁可通过结合并激活尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic AcetylcholineReceptors，nAChR)，促进肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。近年来，全基因组关联研究(GWAS)表明，位于15号染色体长臂，编码尼古丁乙酰胆碱受体CHRNA5/A3/B4基因簇的变异与吸烟相关性肺癌密切相关。其中，编码α5-尼古丁乙酰胆碱受体(α5-nAChR)的基因CHRNA5与肺癌的发生发展尤为相关，但其在肺癌发生发展中作用及机制尚不明确。
　　尼古丁结合肺癌细胞膜表面nAChRs，引起nAChRs通道构象发生变化，并激活下游多重信号通路。我们前期研究发现，α5-nAChR可激活下游PI3K/AKT、MAPK等信号通路影响尼古丁诱导的肺癌细胞增殖、转移及侵袭，初步验证其在肺癌发生中发挥重要作用。为了进一步阐明α5-nAChR在肺癌发生中的作用和机制，我们通过对CHRNA5启动子区域进行生物信息学分析发现，其启动子区域具有信号转导及转录激活因子STAT3的结合位点，但是α5-nAChR与STAT3之间相互作用关系以及对肺癌细胞功能的影响未见报道。
　　本课题拟研究α5-nAChR、STAT3在非小细胞肺癌组织标本中的表达及与相关临床病理参数的关系，同时分析α5-nAChR/STAT3反馈调节环路在尼古丁诱导非小细胞肺癌细胞增殖过程中的作用及机制，将有助于进一步明确α5-nAChR在NSCLC发生发展过程中所发挥的作用，对于进一步研究NSCLC的防治具有重要的理论意义和实际应用前景。
　　[目的]
　　1.检测NSCLC组织中α5-nAChR与pSTAT3的表达，并分析与吸烟史、生存期等相关临床病理参数的相关性;
　　2.体外研究NSCLC细胞中α5-nAChR与STAT3相互调节作用的机制及在尼古丁促进NSCLC细胞增殖中的作用。
　　[方法]
　　1.通过免疫组化方法检测NSCLC组织病理标本中α5-nAChR和STAT3表达;并分析α5-nAChR的表达与患者吸烟史之间关系。
　　2.通过在线数据库分析α5-nAChR的表达对吸烟相关性肺腺癌患者生存和生存期的影响，同时通过患者病例资料，使用Kaplan-Meier方法分析并绘制生存曲线，分析α5-nAChR与pSTAT3表达双阳性对肺腺癌患者生存期的影响。
　　3.NSCLC细胞系在尼古丁作用下，通过Western blot方法检测α5-nAChR、pSTAT3和tSTAT3的表达变化。
　　4.设计合成针对CHRNA5基因的小干扰RNA片段，经lipo2000介导转染A549和H1299 NSCLC细胞，Western blot和RT-PCR方法分别检测尼古丁处理组、siRNA-CHRNA5组和（尼古丁+siRNA-CHRNA5组）中α5-nAChR和下游JAK2/STAT3的表达变化。
　　5.ChIP实验检测NSCLC细胞中STAT3与CHRNA5启动子区域有无结合位点。
　　6.设计合成针对STAT3基因小干扰RNA片段，经lipo2000介导转染A549细胞，Western blot和RT-PCR方法分别检测尼古丁处理组、siRNA-STAT3组和（尼古丁+siRNA-STAT3组）中STAT3、JAK2及α5-nAChR的表达变化。
　　7.CCK-8方法检测干扰α5-nAChR和/或STAT3后对尼古丁促进NSCLC细胞增殖的影响。
　　[结果]
　　1.免疫组织化学结果显示，在130例NSCLC组织病理标本中，α5-nAChR和STAT3的阳性表达率分别为60％和66.9％，在87例STAT3高表达的肺癌组织中，其中有58例α5-nAChR表达水平提高，差异显著(P＜0.05)。此外在55例NSCLC患者组织病理标本中，25例患者有吸烟史，其中19例α5-nAChR表达阳性，表明α5-nAChR表达和吸烟史密切相关且有统计学意义(P=0.022)。
　　2.数据库结果显示，在具有吸烟史的肺腺癌患者中，α5-nAChR表达阳性的患者生存期明显低于α5-nAChR表达阴性的患者(P＜0.05)。同时Kaplan-Meier法计算生存率并绘制生存曲线分析，α5-nAChR(+)/STAT3(+)的患者生存期明显比α5-nAChR（-）/STAT3(+)(P=0.034)和α5-nAChR(+)/STAT3（-）(P=0.026)的患者低。
　　3.Western blot检测结果显示，相对于对照组，1μM尼古丁刺激A549、H1299和H1975 NSCLC细胞系16h后，α5-nAChR和pSTAT3在蛋白水平表达均升高，且差异有统计学意义(P＜0.05)，但tSTAT3蛋白水平不发生变化。
　　4.siRNA-CHRNA5转染A549、H1299 NSCLC细胞后，与阴性对照组相比，siRNA-CHRNA5组α5-nAChR、JAK2和STAT3表达水平下降(P＜0.05)，与1μM尼古丁组相比，（1uM尼古丁+siRNA-CHRNA5）组，α5-nAChR、JAK2和STAT3表达水平下降(P＜0.05)。
　　5.ChIP实验结果表明，CHRNA5启动子区域具有pSTAT3蛋白转录结合位点，1μM尼古丁刺激A549细胞后，pSTAT3与CHRNA5启动子区域结合明显增加(P＜0.05)，当siRNA-STAT3转染肺癌细胞后，pSTAT3与CHRNA5启动子区域结合降低，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.siRNA-STAT3转染A549细胞后，与阴性对照组相比，siRNA-STAT3组α5-nAChR、JAK2和STAT3表达水平下降(P＜0.05)，与1uM尼古丁组相比，(1uM尼古丁+siRNA)转染组，5-nAChR、JAK2和STAT3表达水平下降(P＜0.05)。
　　7.通过A549、H1299细胞CCK-8实验，对比阴性对照组，发现siRNA-CHRNA5和/或siRNA-STAT3转染组NSCLC细胞增殖抑制较阴性对照组升高(P＜0.05)。在1μ M尼古丁组，与尼古丁+siRNA-CHRNA5/siRNA-STAT3转染组相比，转染组细胞增殖明显受抑制(P＜0.05)。
　　[结论]
　　1.在NSCLC组织中，α5-nAChR表达明显高于癌旁组织，且和患者吸烟史1密切相关，α5-nAChR高表达伴随着患者较低的生存率，提示α5-nAChR可能是肺癌治疗和判断生存期的重要分子。
　　2.在NSCLC细胞中，尼古丁可通过结合并激活细胞膜上α5-nAChR，激活下游JAK2-STAT3信号通路，pSTAT3结合CHRNA5启动子区域并调控α5-nAChR表达，证明在α5-nAChR和STAT3之间存在一个反馈调节环路，在尼古丁促进非小细胞肺癌的增殖中起重要作用，并可为肺癌靶向治疗研究提供新的实验方向和依据。

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