Cytophaga hutchinsonii纤维素结晶区降解相关基因chu_3220和chu_1557的研究

摘要

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，对纤维素的开发利用是人类解决资源能源危机的重要途径之一。纤维素是由β-D-吡喃葡萄糖单元通过β-1，4-糖苷键连接形成的无分支长链，它含有结晶区和非结晶区结构。由于纤维素大分子间、纤维素大分子内部以及纤维素和水分子问氢键的存在，纤维素的结晶区结构难以被降解。纤维素结晶区的破坏被认为是纤维素利用的第一步和限速的关键步骤。微生物对纤维素的降解和转化是自然界碳循环的主要环节，并形成了不同的纤维素降解策略。目前，有两种研究得较清楚的纤维素降解机制:游离纤维素酶机制和纤维小体机制。多数的好氧纤维素降解微生物降解纤维素通过游离纤维素酶机制，其中很多的纤维素酶含有碳水化合物结合结构域(carbohydrate bindingmolecule，CBM)。多数的厌氧微生物降解纤维素通过纤维小体机制，每个纤维小体都含有一个支架蛋白，而每个支架蛋白上都有一个CBM结构域。CBM结构能够结合并增溶结晶纤维素，起到破坏纤维素结晶区的作用。除了CBM外，已发现的能够破坏纤维素结晶区的蛋白还有expansins，expansin-like protein，swollenins, lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs)等。
　　Cytophaga hutchinsonii是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，能够高效地降解结晶纤维素，如滤纸和棉纤维等。分析C.hutchinsonii的基因组序列发现它没有外切纤维素酶，并且内切纤维素酶都不含CBM结构。C.hutchinsonii降解纤维索需要与纤维素底物直接接触，且大多数的纤维索酶活都是细胞偶联的。基因组分析显示它也不含有编码纤维小体特征的锚定(dockerin)或粘附(cohesion)结构域。因此，C.hutchinsonii可能采用一种全新的且未知的纤维素降解机制，其小同于已知的游离纤维素酶机制和纤维小体机制。C.hutchinsonii能够利用葡萄糖、纤维寡糖和纤维素作为底物生长，然而，在以纤维素为唯一碳源生长时在其培养基上清中未检测到还原糖产物的积累。推测C.hutchinsonii可能的纤维素降解机制:在它的细胞表面可能存在一个蛋白复合体能够将单个的纤维素链从纤维素上剥离并转运到周质空问，在周质空问中纤维素链被纤维素酶降解。C.hutchinsonii能够降解结晶纤维素，然而，除了CBM，它也不含有expansins，expansin-like protein，swollenins和LPMOs等能够破坏纤维素结晶区的蛋白，其破坏纤维素结晶区结构的机制未知。
　　近几年，随着C.hutchinsonii遗传操作技术的不断发展，其纤维素降解机制的研究有了一定的进展。本文首先尝试了对C.hutchinsonii遗传操作技术的改进，获得了一种基于FLP/FRT重组系统的外源DNA插入整合到基因组特定位点上的方法;同时，利用转座子插入突变方法筛选到2个参与C.hutchinsonii纤维素降解的关键基因，并分别对其基因功能进行了深入研究。在此基础上，也探讨了C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的影响因素。这些工作对揭示C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制有重要的意义。具体内容如下:
　　1.建立了一种基于FLP/FRT重组系统的外源DNA插入整合技术
　　目前，在C.hutchinsonii中表达外源基因常用质粒作为载体，然而质粒存在不稳定、需要添加抗生素维持其存在等缺点。前期，实验室也利用线性DNA双交换同源重组的方法成功地将外源DNA片段整合到C.hutchinsonii的基因组上，但是较长的同源片段限制了外源DNA片段的大小，不利于大片段DNA的整合。来源于Saccharomyces cerevisiae的FLP/FRT位点专一性重组系统是最有效的遗传工具之一，广泛应用于基因敲除、基因重组等领域。实验室前期成功地将FLP/FRT重组系统改造应用于C.hutchinsonii中，实现了基因的无标记敲除。
　　本文利用FLP重组酶可以识别基因组上的和环形片段上的FRT位点，使得环形片段整合到基因组上的特点，建立了一种可以将外源DNA片段插入整合到C.hutchinsonii基因组上的技术。首先，我们在C.hutchinsonii的一个假基因(chu_3328)位置插入一个FRT位点，构建了一个含有单一FRT位点的出发菌株。同时也构建了一个含有单一FRT位点的自杀质粒，通过FLP重组酶的作用可以将自杀质粒整合到chu3328位置。我们用此方法成功地将lacZ基因整合到了C.hutchinsonii基因组上并表达。此方法将外源 DNA片段整合到C.hutchinsonii的基因组的特定位点，不需要额外添加抗生素维持其稳定，遗传背景清晰明确;仅需要FRT位点的存在就可以完成整合，不需要较长同源臂的存在。实验室前期建立的基于FLP/FRT重组系统的无标记敲除技术在敲除目的基因后会存在一个FRT位点，而我们也可以利用此FRT位点成功实现基因的原位回补，此方法比质粒回补或双交换回补操作更简单，结果更稳定。
　　2.chu3220基因功能研究
　　C.hutchinsonii基因组含有3790个开放阅读框，其中仅1986个通过预测进行了功能注释。前期，实验室建立了转座子插入突变的方法筛选与纤维素降解相关的基因。我们利用转座子HimarEm3插入突变的方法筛选到一株纤维素降解缺陷菌株。反向PCR确定转座子插入位点为chu3220。敲除chu3220后获得突变株Δ3220，验证其纤维素降解表型与插入突变缺陷菌株一致。RT-PCR显示Δ3220中chu3220的临近基因的转录未受到chu3220敲除的影响，说明chu3220是结晶纤维素降解的关键基因。
　　分析△3220在不同碳源中的生长情况，发现突变株在葡萄糖、纤维二糖和无定型纤维素中生长速率和最大生物量都不低于野生型，但是在Avicel中的生长速率和最大生物量都明显低于野生型，说明了chu3220的缺失影响C.hutchinsonii对纤维素结晶区的降解。X光衍射（X-ray diffraction， XRD）检测Avicel的结晶度发现野生型处理后的Avicel结晶度降低，而突变株处理后的Avicel结晶度升高。扫面电子显微镜(SEM)检测Avicel表面形态，发现Avicel表面粗糙不规则，而野生型处理后的Avicel表面光滑整齐，推测C.hutchinsonii通过一种“剥皮”方式降解纤维素的结晶区和非结晶区。观察突变株处理后的Avicel表面时发现它和未处理的Avicel表面类似，都比较的粗糙且不规则。通过检测突变株的生长、Avicel结晶度变化和表面形态变化说明了chu3220是C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的关键基因。
　　CHU_3220的分子量为205 kDa，是一个未知功能蛋白，含有一个CHU_C结构域和15个PbH l结构域。实验发现CHU_3220的CHU C结构与其蛋白定位相火，而 PbHl推测与蛋白的相互作用相关。CHU_3220定位于细胞外表面，是一个纤维素结合蛋白，其表达水平受到纤维素的诱导。chu3220敲除后突变株的细胞表面内切纤维素酶酶活明显降低，然而，这些内切纤维素酶的转录水平也明显的降低。CHU_3220与已知的纤维小体的支架蛋白有很多的相似性，但并未找到CHU_3220与内切纤维素酶相互作用的证据。综合以上结果，我们推测CHU_3220可能是C.hutchinsonii细胞表面的蛋白复合体的组成成分，起到剥离单个纤维素链，破坏纤维素结晶区的作用。
　　同时，本文也使用了离子色谱检测C.hutchinsonii的纤维素降解产物。野生型在Avicel中培养5h后，检测其培养基上清发现了葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖，说明C.hutchinsonii细胞表面的纤维素酶能够部分降解纤维素。然而，随着时问延长，培养基中的还原糖逐渐减少，在24 h时检测不到还原糖的存在。同时，我们也检测了C.hutchinsonii在24 h时的胞内还原糖，发现了葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的存在，说明了C.hutchinsonii能够将纤维寡糖转运到周质空间进行降解。检测突变株的胞内还原糖时也发现了纤维寡糖的存在，说明了CHU_3220的缺失不影响纤维寡糖的转运。
　　除了破坏纤维素氢键相关的蛋白外，C.hutchinsonii破坏纤维素结晶区结构还需要ATP的供应和完整细胞结构的存在。在培养基中添加NaN3后，C.hutchinsonii不能降解结晶纤维素，但是能够降解无定型纤维素，说明结晶区的破坏需要能量。TritonX-100能够破坏细胞的膜结构，但不影响蛋白间的相互作用。使用Triton X-100处理C.hutchinsonii细胞后发现其处理后的纤维素结晶度升高，说明纤维素的无定型区被降解。与已知的纤维素结晶区利用方式不同，C.hutchinsonii降解纤维素结晶区不仅依靠参与纤维素结晶区破坏的相关蛋白，还需要完整的细胞结构和能量的供应。
　　3.chu_1557基因功能研究
　　chu_1557是通过HimarEm3转座子筛选到的另一个影响C.hutchinsonii纤维素降解相关的基因。chu_1557基因定点敲除(Δ1557)后，RT-PCR检测发现chu_1557的缺失未影响前后基因的转录。CHU_1557的分了量为391.4kDa，是一个未知功能蛋白，含有一个N-端信号肽和C-端保守结构域(C-terminaldomain，CTD)，可能通过Ⅸ型分泌系统(typeⅨ secretion system.T9SS)穿越外膜并锚定于细胞外膜的A-LPS上。通过Western blot定位CHU_1557，发现其位于细胞外膜的外表面，且是一个纤维索结合蛋白。检测野生型在葡萄糖培养条件下的chu_1557表达水平变化，发现chu_1557在延滞期表达水平明显上调，而在对数期表达水平下降，说明chu1557可能与C.hutchinsonii的启动生长相关。而在纤维素培养条件下，其对数期表达水平仍然上调，说明其与纤维素降解密切相关。
　　检测△1557的生长时发现突变株的延滞期与葡萄糖浓度相关。在高浓度葡萄糖(0.4％，w/v)培养条件下突变株的延滞期和野生型相差不大，而在低浓度葡萄糖(0.1％，w/v)培养条件下突变株的延滞期比野生型长60 h。将突变株分别用不同的葡萄糖浓度培养，发现随着葡萄糖浓度的升高，突变株的延滞期降低，在达到0.4％(w/v)时突变株的延滞期最短。同时，将低浓度葡萄糖培养后的突变株再接种到低浓度葡萄糖条件下培养，发现突变株的延滞期明显缩短。在以无定型纤维素和结晶纤维素为碳源的培养基中，突变株的延滞期比野生型长约72 h，而低浓度葡萄糖预培养的突变株其延滞期也明显缩短，和野生型相差不大。低浓度和高浓度葡萄糖预培养的突变株在结晶纤维素中的最大生物量分别为野生型的33％和62％，说明突变株能够利用部分的结晶纤维素。
　　检测突变株的葡萄糖吸收情况时发现CHU_1557影响C.hutchinsonii对低浓度葡萄糖的吸收，但不影响对高浓度葡萄糖的吸收，且低浓度预培养的突变株其对低浓度葡萄糖的吸收速率与野生型相似。纤维素结晶区的破坏需要能量，CHU_1557的缺失导致葡萄糖的吸收速率降低，影响了突变株破坏纤维素结晶区的能量供应。检测突变株的胞内ATP水平时发现明显少于野生型的，而在测定其ATP合成酶组分的转录水平时发现均无下降，说明了CHU_1557的缺失导致突变株需要更多的能量供其生长。由此推测CHU1557的两方面作用:一是影响了胞外低浓度葡萄糖的吸收，导致合成的ATP减少;二是CHU_1557作为细胞表面蛋白复合体的组分消耗能量参与破坏纤维素结晶区的降解，突变株的生长需要消耗更多的ATP，导致突变株胞内ATP水平明显小于野生型。突变株因无充足的能量供应导致其降解结晶纤维素效率降低，而在提供更多的能量如添加葡萄糖或低浓度葡萄糖预培养时会有助于突变株降解结晶纤维素。
　　本文首先在C.hutchinsonii中建立了基于FLP/FRT重纰系统的外源DNA插入整合技术，此方法消除了质粒遗传不稳定性的特点，且能够利用基于FLP/FRT重组系统构建的无痕敲除所产生的的单一FRT位点，实现敲除基因的原位回补和目的基因的表达。C.hutchinsonii能够高效地降解结晶纤维素，但是具体机制并不清楚。本文通过分析胞内和胞外的纤维素水解产物发现C.hutchinsonii能够通过胞内降解和细胞表面降解两条途径降解纤维素。纤维素结晶区的破坏是纤维素降解的限速步骤，本文通过插入突变的方法首次筛选到两个影响纤维素结晶区降解的关键基因chu_3220和chu_1557。研究发现CHU_3220和CHU_1557可能是细胞表而的蛋白复合体的重要组分，而此蛋白复合体可能负责纤维素结晶区纤维素链的剥离。我们发现纤维素结晶区的破坏除需要结晶区降解相关蛋白参与外，还需要完整的活细胞提供能量。C.hutchinsonii的纤维素降解机制明显不同于已发现的游离纤维素酶降解系统和纤维小体降解系统，本文对C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的研究，促进了我们对C.hutchinsonii新型纤维素降解机制的了解，也将对纤维素资源的高效转化利用具有积极的推动作用。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 研究背景

1．1 纤维素资源的开发利用

1．2 纤维素的结构

1．3 纤维素的微生物降解

1．3．1 纤维素降解微生物

1．3．2 纤维素降解机制

1．3．3 纤维素结晶区的降解策略

1．4 Ⅸ型分泌系统

1．5 Cytophaga hutchinsonii研究背景

1．5．2 C．hutchinsonii的特征

1．5．3 C．hutchinsonii的研究进展

1．7 论文的立题和工作思路

第二章 基于FLP／FRT重组系统外源DNA插入整合技术的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 菌种及质粒

2．1．2 实验中用到的引物

2．1．3 主要试剂及仪器

2．1．4 培养条件

2．1．5 分子生物学常用反应体系及操作

2．1．6 E．coli感受态的制备与转化

2．1．7 C．hutchinsonii感受态的制备与转化

2．2 实验结果

2．2．1 含单个FRT位点C．hutchinsonii出发菌株的构建

2．2．2 基于FLP／FRT重组系统的基因组插入整合质粒的构建

2．2．3 外源基因基于FLP／FRT重组系统的表达实例

2．3 讨论

第三章 chu_3220基因功能研究

3．1 材料和方法

3．1．1 菌种及质粒

3．1．2 实验中用到的引物

3．1．3 主要试剂及仪器

3．1．4 培养条件

3．1．5 插入突变筛选纤维素降解缺陷株

3．1．6 滤纸降解实验

3．1．7 基因敲除

3．1．8 再生无定形纤维素(RAC)的制备

3．1．9 生长曲线测定

3．1．10 RT-PCR

3．1．11 RT-qPCR

3．1．12 XRD测定纤维素结晶度

3．1．13 纤维素底物利用效率测定

3．1．15 蛋白表达与纯化

3．1．16 纤维素结合实验

3．1．17 蛋白定位

3．1．18 纤维素酶活测定

3．1．19 菌体对纤维素吸附效率测定

3．1．20 离子色谱测定纤维素降解产物

3．1．21 基因表达水平测定

3．1．22 纤维素内切酶酶活的复性电泳

3．2 结果

3．2．1 转座子插入突变获得滤纸降解缺陷株

3．2．2 生物信息学分析

3．2．3 chu_3220是纤维素结晶区降解必需基因

3．2．4 CHU_3220是纤维素结合蛋白

3．2．5 CHU_3220的亚细胞定位

3．2．6 chu_3220在不同碳源中的表达水平变化

3．2．7 chu_3220对纤维素酶的影响

3．2．8 chu_3220对纤维素水解产物的影响

3．2．9 影响纤维素结晶区降解的其他因素

3．3 讨论

第四章 chu_1557基因功能研究

4．1 材料和方法

4．1．1 菌种及质粒

4．1．2 实验中用到的引物

4．1．3 主要试剂及仪器

4．1．4 培养条件

4．1．5 转座子插入突变筛选纤维素降解缺陷株

4．1．6 滤纸降解实验

4．1．7 生长曲线测定、基因敲除和XRD测定纤维素结晶度

4．1．8 基因表达水平检测

4．1．9 葡萄糖吸收实验

4．1．10 胞内ATP测定

4．1．11 RT-PCR、RT-qPCR、蛋白定位、纤维素内切酶酶活测定

4．1．12 纤维素吸附蛋白的制备

4．2 结果

4．2．1 转座子插入突变获得滤纸降解缺陷株

4．2．2 chu_1557表达水平检测

4．2．3 chu_1557影响纤维素结晶区降解

4．2．4 XRD测定纤维素的结晶度

4．2．5 chu_1557与葡萄糖的吸收相关

4．2．6 低浓度葡萄糖预培养能够回复突变株纤维素降解的能力

4．2．7 添加葡萄糖能够回复突变株降解纤维素的能力

4．2．8 chu_1557的缺失影响了胞内ATP水平

4．2．9 CHU_1557的亚细胞定位

4．2．10 CHU_1557是纤维素结合蛋白

4．2．11 chu_1557对纤维素酶的影响

4．2．12 chu_1557的缺失对外膜蛋白的影响

4．3 讨论

全文总结及展望

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢

学位论文评阅及答辩情况表