人ABO(H)血型抗原的酶法模块化组装

摘要

ABO(H)血型抗原是人类主要的血型抗原，其抗原表位决定簇为特定的糖链结构，这些特定的糖链可以与多肽结合形成糖蛋白，或者与脂类结合形成鞘糖脂。ABO(H)抗原不仅存在于红细胞表面，也广泛分布于人体器官的上皮和内皮细胞，周围神经系统的神经元以及母乳、唾液和尿液中。这些寡糖抗原与急性溶血性输血反应以及骨髓和器官移植的免疫反应密切相关。越来越多的研究表明，这些抗原作为受体在各种细菌、病毒和寄生虫感染，以及肿瘤的转移中扮演着重要的角色。
　　ABO(H)血型抗原包括A抗原特征三糖、B抗原特征三糖和H抗原特征二糖，三种抗原表位决定簇。根据其生物合成途径中二糖前体结构的不同，ABO(H)抗原可以进一步分为5个亚型。这5种二糖前体分别为Galβ1-3GlcNAcβ1-R（Ⅰ型），Galβ1-4GlcNAcβ1-R(Ⅱ型),Galβ1-3GalNAcα1-R(Ⅲ型),Galβ1-3GalNAcβ1-R(Ⅳ型)，Galβ1-4Glcβ1-R（Ⅵ型）。分别以这5种二糖前体为底物，在3种糖基转移酶的催化下依次将3种不同的单糖引入到前体二糖的非还原末端就得到全部15种天然ABO(H)抗原结构。
　　ABO(H)血型抗原的重要生物学意义和临床重要性，使得其抗原的合成成为近60年来糖合成领域的一个热点。目前，就ABO(H)抗原的合成已发展出许多不同的方法，如化学法合成、化学酶法合成、酶法合成以及全细胞发酵等。化学合成策略的操作条件较为严格，需要繁琐的保护、脱保护操作和大量的分离纯化操作，因而导致合成总收率较低，难以实现大量合成以满足其生物学功能的研究。酶法合成方面，酶的来源以及酶的底物专一性限制了其在复杂寡糖大量合成中的应用。全细胞发酵通常只能针对特定的单一抗原结构，且产物难以从混合物中得以纯化。迄今为止，只有加拿大的Todd Lowary课题组通过化学合成实现了全部15种天然ABO(H)血型抗原的系统性合成。
　　本论文成功的发展了一种多样化导向的酶法模块化组装(enzymatic modularassembly, EMA)策略，首次实现了全部15种天然ABO(H)血型抗原结构的系统性合成。本论文工作主要包括以下几个方面:
　　(1)通过化学合成或化学酶法合成，高效、快捷的实现了5种二糖前体的大量合成。
　　(2)分别以TypeⅠ二糖(Galβ1-3 GlcNAcβProN3)，TypeⅡ二糖(Galβ1-4GlcNAcβProN3)，TypeⅢ二糖(Galβ1-3GalNAcαProN3)，TypeⅣ二糖(Galβ1-3GalNAcβProN3)和TypeⅥ二糖(Galβ1-4GlcβProN3)为受体，运用酶法模块化组装策略，通过一步平行反应，完成了全部5种天然H抗原的合成。
　　(3)以5种H抗原为受体，运用2个不同的酶法组装模块，分别平行合成了5种A抗原和5种B抗原。
　　本论文的主要创新点包括以下两个方面:
　　(1)首次实现了全部15种天然ABO(H)血型抗原的系统性酶法合成。
　　(2)发展了高效、快速的酶法模块化组装新策略，分别以5种二糖前体为受体，仅通过3步平行合成就实现了全部15种天然ABO(H)抗原的大量合成。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1 糖科学

1．1 糖生物学

1．2 糖化学

2 寡糖的合成方法

2．1 化学法合成

2．2 酶法合成

2．3 化学酶法合成

3 ABO(H)血型抗原的研究进展

3．1 ABO(H)血型抗原概述

3．2 ABO(H)血型抗原的结构

3．3 ABO(H)血型抗原的合成研究进展

第二章 ABO(H)血型抗原的酶法模块化组装

1 课题的设计和提出

2 酶法模块化组装(EMA)策略

2．1 酶法组装模块1(EMA 1)

2．2 酶法组装模块2(EMA 2)

2．3 酶法组装模块3(EMA 3)

3 化学酶法合成5个二糖前体

4 运用酶法组装模块1平行合成H抗原

5 运用酶法组装模块2平行合成A抗原

6 运用酶法组装模块3平行合成B抗原

第三章 总结和展望

1 全文总结

2 创新点

3 展望

第四章 实验部分

1 一般方法

1．1 菌种培养

1．2 酶的分离纯化

1．3 各种buffer的配置

2 实验过程

2．2 化学法合成GalNAcαProN3(2)

2．4 化学法合成LactoseβProN3(8)

2．5 酶法合成Galβ1-3GlcNAcβProN3(4)

2．6 酶法合成Galβ1-4GlcNAcβProN3(5)

2．8 酶法合成Galβ1-3GalNAcβProN3(H7)

2．9 Galβ1-3(Fucα1-2)GlcNAcβProN3(9)

2．10 Galβ1-4(Fuc1α-2)GlcNAcβProN3(10)

2．11 Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcαProN3(11)

2．12 Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcβProN3(12)

2．13 Galβ1-4(Fucα1-2)GlcβProN3(13)

2．14 GalNAcα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GlcNAcβProN3(14)

2．15 GalNAcα1-3Galβ1-4(Fucα1-2)GlcNAcβProN3(15)

2．16 GalNAcα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcαProN3(16)

2．17 GalNAcα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcβProN3(17)

2．18 GalNAcα1-3Galβ1-4(Fucα1-2)GlcβProN3(18)

2．19 Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GlcNAcβProN3(19)

2．20 Galα1-3Galβ1-4(Fucα1-2)GlcNAcβBProN3(20)

2．21 Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcαProN3(21)

2．22 Galα1-3Galβ1-3(Fucα1-2)GalNAcβProN3(22)

2．23 Galα1-3Galβ1-4(Fucα1-2)GlcβProN3(23)

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文