正常小鼠外周成熟T细胞回归胸腺及其功能表达的探究

摘要

在对胸腺的功能研究中，一直把胸腺当作一个免疫“特赦”器官看待，抗原和大分子不能进入胸腺从而避免了胸腺内发生免疫反应。根据中枢耐受理论，如果在胸腺内植入外界抗原，那么该抗原将会被发育中的T细胞识别并对阳性选择和阴性选择产生影响进而形成耐受。根据我们先前的研究发现，当把肿瘤细胞注射到胸腺后，并没有诱导形成肿瘤细胞的耐受，肿瘤细胞最终会被清除。并且流式分析显示，在注射人肺癌细胞A549后，胸腺内CD4+、CD8+T细胞的数量增加。那么这些增多的淋巴细胞会不会是来自于外周呢？在给免疫缺陷小鼠移植T细胞的实验中发现，异体的成熟T细胞可以进入胸腺，但正常小鼠的外周成熟T细胞是否也具有这种现象还不确定。
　　因此针对以上问题，我们选用正常小鼠作为实验对象，首先在其脾脏中注射CFDA SE荧光染料，通过流式检测胸腺内是否含有表达CFDA SE荧光信号的细胞，检测外周T细胞能迁回胸腺;其次我们在外周免疫过人肺癌细胞A549抗原的小鼠和未免疫小鼠的胸腺中分别注射等量的A549细胞，通过石蜡切片和流式细胞术分析对比胸腺内发生的免疫反应、抗原细胞在胸腺内的状态以及T细胞亚群含量的变化，并对发生于胸腺的应答反应做进一步探究。
　　通过以上实验，我们得到以下结果:
　　1.胸腺内可以检测到CFDA SE阳性细胞，并且这些细胞绝大多数呈CD3阳性;
　　2.石蜡切片结果显示，免疫小鼠的胸腺内发生的免疫反应较未免疫小鼠更加剧烈，胸腺在相对较短的时间内即可恢复正常;
　　3.流式分析结果显示，与未免疫小鼠相比，A549细胞在免疫小鼠胸腺内的存活时间缩短;
　　4.胸腺微创注射后第5天，外周免疫小鼠和未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠相比，胸腺中CD4+和CD8+T细胞的数量都明显增加，但免疫小鼠的胸腺中CD8+/CD4+的比值较未免疫小鼠显著升高，而未免疫小鼠与未进行胸腺微创注射的小鼠之间无明显差异。
　　通过以上结果，我们得出以下结论:
　　1.正常小鼠的胸腺内存在来自外周的T细胞。这种回迁现象不仅发生于免疫缺陷小鼠，也发生于正常小鼠。
　　2.用抗原外周免疫后，当胸腺内再次出现相同抗原时，胸腺内会发生更加及时、剧烈的免疫反应。
　　根据以上结论，我们推测外周免疫后一部分记忆T细胞进入胸腺，当再次遇到相应抗原时，记忆T细胞迅速增殖并对抗原产生记忆性杀伤。外周成熟T细胞回归胸腺可能是机体保护胸腺免于抗原感染的一种正常机制，防止机体形成对外来抗原的耐受。

目录

声明

摘要

符号说明(英文简写)

1 绪论

1．1 T细胞的发育

1．1．1 胸腺

1．1．2 前体T细胞在胸腺内的迁移分化

1．1．3 T淋巴细胞循环(T细胞的体外成熟)

1．2 免疫记忆

1．3 胸腺对外周免疫的影响

1．3．1 免疫耐受

1．3．2 胸腺与中枢耐受

1．3．3 胸腺中枢耐受的分子机制

1．4 抗原对胸腺的影响

1．5 外周成熟T细胞回归胸腺的研究

1．6 课题思路及研究意义

2 实验材料和实验方法

2．1 仪器设备与实验材料

2．1．1 仪器设备

2．1．2 实验材料

2．1．3 主要试剂及配置

2．2 实验方法

2．2．1 CFDA SE体外标记脾脏细胞

2．2．2 小鼠脾脏注射CFDA SE

2．2．4 人肺癌细胞A549的复苏

2．2．5 人肺癌细胞A549的传代培养

2．2．6 小鼠外周免疫

2．2．7 荧光染料DiI标记人肺癌细胞A549

2．2．8 胸腺微创注射人肺癌细胞抗原

2．2．9 小鼠血清的制备

2．2．1 0胸腺石蜡切片的制作

2．2．1 1石蜡切片HE染色

2．2．1 2免疫扩散

2．2．1 3荧光染料CFDA SE标记人肺癌细胞A549

2．2．1 4小鼠胸腺细胞流式细胞仪检测

3 实验结果

3．1 外周成熟T细胞回归胸腺的研究

3．1．1 CFDA SE体外标记脾脏细胞荧光时效结果

3．1．2 术后小鼠发育情况分析

3．1．3 胸腺内CFDA SE阳性细胞的表达情况

3．1．4 脾脏、胸腺内CFDA SE标记细胞及CD3阳性细胞的含量对比

3．2 外周成熟T细胞在胸腺中的功能探究

3．2．1 外周免疫后小鼠发育情况

3．2．2 DiI标记人肺癌细胞A549细胞效果观察

3．2．3 小鼠血清免疫扩散结果

3．2．4 解剖观察小鼠胸腺

3．2．5 胸腺的组织病理学观察

3．2．6 体外标记CFDA SE人肺癌细胞A549效果

3．2．7 人肺癌细胞在胸腺内的生存状态变化

3．3 胸腺内T细胞亚群含量的变化

3．4 讨论

4 论文总结与展望

参考文献

致谢