含N芳杂环类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂及埃博拉病毒侵入抑制剂的研究

摘要

艾滋病，又称为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是一种广为人知的严重威胁着人类生命健康的传染性疾病。自1981年被首次报道以来，已造成3500多万人的死亡。最新的权威数据显示，近年来艾滋病在全球范围内仍属高发态势，其防控形势依然严峻。
　　人类免疫缺陷病毒HIV(Human immunodeficiency virus)是造成人类艾滋病感染的罪魁祸首。它的感染破坏人体免疫系统功能，继而并发机会性感染和恶性肿瘤，最终导致感染者死亡。HIV属于逆转录病毒，具有两个亚型，其中，HIV-1是全球范围内导致艾滋病感染的主要类型。
　　HIV-1病毒的复制周期非常复杂，主要包括吸附、融合、逆转录、整合、转录、翻译、装配、出芽和释放等一系列过程。这些环节也为我们对HIV病毒的复制进行药物干扰提供了机会。其中，逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)由于在病毒生命周期中极为重要的作用，成为一个非常成熟的抗HIV药物作用靶点。针对逆转录酶的非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)因其高活低毒、选择性强等优点，在临床治疗中广泛应用。
　　二芳基嘧啶类(DAPYs)化合物是NNRTIs的经典代表，已经有两个化合物依曲韦林(ETR)和利匹韦林(RPV)作为新一代药物上市。但相继出现的耐药病毒株、药代动力学性质不佳以及毒副作用等问题严重限制了其应用。因此，研发对靶点结合作用更强、理化性质更优的新型的HIV-1NNRTIs，以提高其抗耐药性和药代性质，依然是目前抗艾滋病药物领域的研究热点。
　　目前此类化合物与逆转录酶复合体的晶体结构已经得到解析，阐明了的DAPY类化合物与RT的结合模式。研究显示，代表性配体分子ETR在结合口袋中呈现“U”型构象，通过四个区域（与两个芳香环形成π-π堆积和疏水作用的A区、与嘧啶环形成氢键作用的B区、开放型凹槽状的蛋白-溶剂界面作用区（C区），以及第四个可拓展的NNRTI进入通道区域（D区））与逆转录酶产生重要的相互作用或潜在的结合力。并且此类结构中的三个芳环基团通过之间的杂原子来进行旋转或平移，从而灵活地调整自身构象以适应结合口袋，并且增强了分子的抗耐药性。在对此充分理解的基础上，我们结合一类具有优秀抗耐药性和药代性质的新型吡咯并嘧啶类DAPY类似物RDEA640的结构特征，在上市药物依曲韦林的结构上尝试对其母环进行优化，期望加强分子与RT中D区的相互作用，并对两翼苯环取代基进行多样化地衍生。由此，在第二章第二节中，我们设计并合成了一类含有桥头N原子的5，7-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物（系列A，共18个化合物），希望发现耐药性和药代性质更好的新型NNRTI。细胞水平的抗HIV病毒活性筛选显示，大部分化合物具有亚微摩尔或微摩尔水平的野生型HIV-1病毒抑制活性。其中活性最高的化合物A5a其半数抑制浓度达到了70纳摩尔，远高于第一代同类上市药物，选择性指数为3999。但所有化合物没有显示出对K103N/Y181C双突变株的抑制活性。抗HIV逆转录酶活性实验证实了此类化合物的作用靶点。我们还通过计算机模拟手段分析了其理化性质和作用模式，为后续结构优化奠定了基础。
　　在第二章第三节中，我们结合最新的生物结构信息，在本课题组大量先期工作的基础上，优选了其中3个最好的中心芳环结构，并新增两个在药化中广泛应用的优势片段，共五种含N芳香杂环作为新设计化合物的中心母环。另外，由于上市药物RPV的氰基乙烯基在与RT结合中的特殊作用模式，我们选取了它作为新化合物左翼苯环对位取代基。通过整合各种优势基团，希望发现各项性质更好的化合物，由此我们设计了系列B NNRTIs，共21个化合物。细胞水平活性测试显示，15个化合物对野生型HIV-1病毒株显示出了200nM以下的EC50值，更有9个化合物显示出了个位数纳摩尔水平的半数抑制能力。其中，化合物B10a活性最高，其EC50值达到1.5纳摩尔，选择性指数达到90730，超过阳性对照药物ETR。随后，我们对活性较高的化合物进行了对多种常见耐药毒株抑制能力的测试，多个化合物显示出良好的抗耐药性。其中，B4c对重要的耐药株K103N和E138K的EC50值分别达到1.8和6.8纳摩尔，高于所有采用的阳性对照药物;对L100I和Y181C的EC50均为10纳摩尔，与ETR和AZT相当。化合物B17a，对野生株和突变株均显示出极其优秀的活性，分别是1.7nM(WT)、11nM(L100I)、1.6nM(K103N)、2.8nM(E138K)、29nM(Y181C)、160nM(Y188L)和84nM(F227L+V106A)。并且由于B17a毒性更低，它显示出了比ETR更好的选择性。小鼠肝微粒体稳定性研究显示，B17a的半衰期为60.8分钟，远超上市药物RPV，与ETR相似，具有广阔的开发前景，更多的成药性评价正在积极开展之中。
　　埃博拉出血热，是一种由埃博拉病毒引起的，多发于灵长类动物的人畜共患传染病，其病死率高达50％到90％。在最近的2014到2016年，西部非洲爆发了有史以来的一次最严重和复杂的埃博拉疫情，引起了全世界范围的极大恐慌和关注。虽然已有几种候选疫苗进入了临床试验阶段，多个药物也正处于研究或开发阶段，但是目前并没有一种特效的埃博拉出血热治疗措施或者药物得到美国FDA的批准，临床上主要采取对症治疗策略。因此，探究埃博拉病毒的传播机制，并且开发出具有针对性的、有效性的治疗方法有着极其重大的科研与社会意义，也是抗病毒药物研究领域的当务之急。
　　哈佛医学院Cunningham教授（合作导师）实验室通过高通量筛选及结构修饰发现了作用于埃博拉病毒侵入人体必需的宿主蛋白NPC1的金刚烷二肽哌嗪类化合物3.47。它具有纳摩尔水平的对埃博拉病毒的体外抑制活性，但较差的药代动力学性质限制了它作为候选药物的继续开发。
　　针对化合物3.47的结构特征和代谢过快的问题，在第三章第二节中，我们系统性、针对性地对其结构中右翼苄基（C1系列）、中间二肽链（C2系列）和左翼金刚烷（C3系列）的易代谢位点进行了替换和封闭等修饰。共设计合成了三个系列，24个化合物。通过细胞水平的活性测试和小鼠肝微粒体代谢稳定性测试等实验，尽管最终没有发现保持一定活性并具有更佳药代动力学性质的化合物，但极大地拓展了此类化合物的构效关系信息。
　　大量药物开发研究显示，分子的理化性质与其药代动力学行为密切相关。由此总结出的药物化学著名规律中，Lipinski五规则以及Gleeson4/400规则都是基于分子量、logP等理化性质的关于化合物成药性的重要统计规律。它们显示，具有较好药代动力学性质的化合物其分子量基本在400左右，脂水分配系数在2-3的范围内。除此之外，还有一些具有指导性的概念和参数，例如配体效率(Ligand efficiency，LE)、亲脂性配体效率(lipophilic ligand efficiency，LLE)和更加综合性的LELP指数。通过它们可以有效地评价分子中分子大小和亲脂性对活性贡献的效率，从而指导药物化学工作，更好地把握化合物药代性质和生物活性的平衡。
　　基于前期工作的基础和上述药物开发规律，我们在第三章第三节中，通过骨架跃迁、生物电子等排等多种药物化学策略，对化合物3.47结构的两翼进行了多轮简化，以降低其分子量和亲脂性，并最终改善其药代动力学性质。在此过程中，我们设计合成了6个系列（C4-C9系列），共86个化合物，发现了多个简化的优势基团，并通过这些优势基团的联合，发现了多个抗埃博拉病毒侵入抑制活性既得到保持、代谢稳定性也得到增加的化合物，如C7a和C7f。其后氘代药物策略的引入及手性化合物的拆分，使我们得到了活性和稳定性进一步提升的化合物C8p、C9g和C9n。更加全面的体外药代动力学评价证明它们的水溶性(＞75μM)、肝微粒体代谢稳定性（鼠，T1/2=2.0-11min;人，T1/2=6.7-32.4min）、血浆稳定性（在4h以上稳定）、血浆蛋白结合率(86.0-94.0％)等性质均比先导化合物3.47有很大提升（水溶性5.3μM，小鼠肝微粒体代谢稳定性T1/2=1.0min，mPPB高）。同时，口服方式下的小鼠体内药代动力学评价也证明了C9n具有进一步开发的潜力。更加广泛的药理、药效学评价正在开展之中。
　　总之，该论文针对当前上市的HIV非核苷类逆转录酶抑制剂耐药性及药代动力学性质不佳，以及埃博拉病毒侵入抑制剂先导物药代动力学性质较差的科学问题，经过药物化学的合理设计和化合物的大量合成，获得了一系列具有新型结构、良好抗病毒活性和优化的药代动力学性质的抑制剂，其中多个化合物具有进一步开发的前景。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

第一节 艾滋病与HIV-1病毒

1．艾滋病及其流行现状

2．HIV-1病毒及其结构

3．HIV-1的复制周期及相关抑制剂

第二节 HIV-1逆转录酶的作用、结构与NNRTIs作用机制

2．HIV-1逆转录酶的结构

3．非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)作用机制

4．突变病毒株对NNRTI耐药的分子机制

第三节 埃博拉出血热与埃博拉病毒

1．埃博拉出血热

2．埃博拉病毒及其结构

3．埃博拉病毒的生命周期

第四节 埃博拉病毒药物及治疗手段研究进展

第五节 基于分子理化性质的先导物优化策略

1．分子类药性质及分子“肥胖”

2．基于热力学原理的分子优化策略

3．基于理化性质和参数的分子优化策略

第六节 本章小结

第二章 新型取代含N芳杂环类抗HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂的设计、合成与活性研究

1．经典含N芳杂环DAPY类NNRTIs及其不足

2．DAPY类化合物结合模式特征

第二节 新型5，7-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶类HIV-1 NNRTI(系列A)的设计、合成与活性研究

1．新型5，7-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶类HIV-1 NNRTI(系列A)的设计

2．目标化合物的合成

3．目标化合物生物活性评价

4 计算机模拟研究

第三节 基于优势片段的新型DAPY类似物HIV-1 NNRTI(系列B)的设计、合成与活性研究

1．基于优势片段的新型DAPY类似物HIV-1 NNRTI(系列B)的设计

2．目标化合物的合成

3．目标化合物抗HIV活性评价

4．化合物B17a的人肝微粒体稳定性研究

第四节 本章小结

第三章 药代性质驱动的埃博拉病毒侵入抑制剂先导化合物的优化

第一节 背景介绍

第二节 针对易代谢基团的金刚烷二肽哌嗪类埃博拉病毒侵入抑制剂的先导化合物优化

1．针对易代谢基团的结构修饰思路

2．目标化合物的合成

3．目标化合物的活性评价与肝微粒体代谢稳定性研究

第三节 基于分子理化性质的金刚烷二肽哌嗪类埃博拉病毒侵入抑制剂的先导物优化

1．基于分子理化性质的金刚烷二肽哌嗪类埃博拉病毒侵入抑制剂的先导物优化设计

2．目标化合物的合成

3．目标化合物的活性评价与肝微粒体代谢稳定性研究

4．目标化合物更全面的药代动力学性质评价

第四节 本章小结

第四章 总结与展望

第一节 总结

1．新型取代含N芳杂环类抗HIV非核苷类逆转录酶抑制剂的设计、合成与活性研究

2．药代性质驱动的埃博拉病毒侵入抑制剂先导化合物的优化

3．本论文创新性总结

4．本论文不足之处

第二节 展望

附录

参考文献

致谢

攻读博士学位期间科研成果及奖励情况