减毒型溶瘤病毒治疗脑胶质瘤干细胞的体外实验研究

摘要

目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，肿瘤表现为浸润性生长，目前无论手术治疗还是其他治疗，均无法彻底治愈胶质瘤，即使联合术后的放化疗，肿瘤仍会复发，导致病人预后不良。因此，寻找新的治疗方法，有效的杀伤胶质瘤细胞成为了一个新的重要的研究课题。近年来，脑胶质瘤干细胞的发现对胶质瘤的治疗有重要的意义，因为脑胶质瘤干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，是脑胶质瘤术后复发和对放化疗抵抗的根源。因此，脑胶质瘤干细胞已经成为治疗脑胶质瘤潜在的新靶点。虽然替莫唑胺已经被证实有抗肿瘤的作用，但由于部分病人出现耐药性，导致其治疗效果不好，不能阻止肿瘤的进一步生长和复发，因此也需要新的治疗方式来治疗胶质瘤。本实验中我们从手术病人中获取新鲜的脑胶质瘤组织，从新鲜的标本中分离并用培养干细胞的方法培养出胶质瘤干细胞，并研究建立脑胶质瘤浸润动物模型的可行性。溶瘤病毒为治疗胶质瘤提供了一种新的治疗方法，之前的体外实验我们已经证实了重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和重组双删除痘病毒(vvDD)能够感染并杀死胶质瘤细胞系，动物实验也证实了其能够延长动物模型的生存期。本实验中，我们将进一步证实重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和痘苗病毒(vvDD)在体外治疗胶质瘤干细胞的有效性。
　　方法:1.我们对12例手术切除的新鲜的脑胶质瘤组织进行胶质瘤干细胞的培养，对形成细胞球的胶质瘤干细胞进行增殖以及分化实验，并检测形成细胞球的胶质瘤干细胞的表面标志物，确定其干细胞属性。2.应用逆转录病毒转染将增强绿色荧光蛋白(EGFR)转染入胶质瘤干细胞，用转染增强型绿色荧光蛋白的干细胞进行动物模型体内成瘤实验，从而建立脑胶质瘤浸润动物模型。3.检测我们培养出的胶质瘤干细胞在体外对替莫唑胺的敏感性，然后用不同剂量的重组型水泡口炎病毒(VSV△M51)和痘苗病毒(vvDD)感染这些胶质瘤干细胞，特别是对替莫唑胺耐药的干细胞，观察其在体外对胶质瘤干细胞的杀伤作用。
　　结果:1.12例手术切除的胶质瘤标本中，有9例能够成功培养出胶质瘤干细胞球体。经实验检测，这些培养出的胶质瘤干细胞球体均具有自我增殖和分化的能力，所有的胶质瘤干细胞球体均表达神经干细胞特异性的标志物巢蛋白(Nestin)，9例中有7例能够表达神经干细胞标志物CD133。胶质瘤干细胞球体经分化后可以形成贴壁的胶质瘤细胞，这些胶质瘤细胞表达成熟神经细胞的标志物:抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和抗人微管相关蛋白-2(MAP-2)。2.胶质瘤干细胞可以转染增强绿色荧光蛋白(EGFR)，转染EGFR后的胶质瘤干细胞在免疫缺陷小鼠颅内形成与人脑胶质瘤相类似，具有浸润性生长特征的肿瘤。3.溶瘤病毒VSV△M51和vvDD能够感染对替莫唑胺耐药的胶质瘤干细胞，并可以造成细胞的病变效应，破坏了胶质瘤干细胞的自我更新能力，并有效的杀伤胶质瘤干细胞及其分化形成的胶质瘤细胞。
　　结论:1.采用神经干细胞培养方法可以成功的培养出胶质瘤干细胞，这些胶质瘤干细胞且具有干细胞自我更新，多向分化以及成瘤能力。2.经转染后的胶质瘤干细胞在动物模型体内能够形成肿瘤，形成的肿瘤具有与人胶质瘤相似的浸润性生长的特征，可以更好的代表人类的胶质瘤，在未来胶质瘤治疗的研究中将具有非常广泛的应用前景。3.实验证实溶瘤病毒VSV△M51和vvDD能够成功感染并有效杀伤替莫唑胺耐药的胶质瘤干细胞，这可能为治疗对替莫唑胺耐药的胶质瘤患者提供一种新的治疗方法。

目录

声明

摘要

符号说明

引言

参考文献

第一部分 人胶质瘤干细胞的分离、培养以及胶质瘤浸润动物模型的建立

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 减毒型溶瘤病毒治疗替莫唑胺耐药的脑胶质瘤干细胞的体外实验

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．下一步实验内容

参考文献

文献综述

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况

学位论文评阅及答辩情况表

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