microRNA-28-3p通过抑制Sox6并激活PI3K/AKT通路促进骨折愈合的研究

摘要

目的:
　　本文在之前报导的基础上，拟经过大量实验，解决以下几点问题:miR-28-3p的表达水平在骨折患者的愈合过程中是如何变化的？它是否可以促进成骨细胞的增殖并抑制凋亡？其下游调控靶点及通路是什么？miR-28-3p是如何通过调节下游基因及信号通路加速骨折愈合的？
　　方法:
　　我们从随机选取2015年3月到2017年3月期间在我院就诊的20例脆性骨折患者，其中有10例患者为手部骨折（男女各半，平均年龄为24.9±2.08）;另外10例患者为关节内骨折（男女各半，平均年龄为24.1±2.69）。患者样本为不同时间点采集的血浆样本:创伤后24小时之内取病人血浆样品，分别于标准化固定治疗后的7天、14天、21天取同一患者血浆，同时取10例从未接受过心力衰竭、肾衰竭、关节痛或自身免疫类疾病治疗的健康人群血浆作为正常对照。利用定量RT-PCR方法检测受试人群在骨折愈合不同时期的miR-28-3p表达量，研究其表达量与骨愈合之间的潜在关系。
　　接下来，我们选取了小鼠成骨细胞系MC3T3-E1，分别转染miR-28-3pmimics、ASO-miR-28-3p及其各自空载作为阴性对照，并分别用MTT方法和流式细胞学方法分析了转染前后细胞的增殖和凋亡水平。此外，检测转染细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl2以及骨生成相关蛋白Col1a1、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ的表达量。
　　根据TargetScan预测的miR-28-3p和野生型Sox63'非编码末端(UTR)的结合位点，将Sox6的3'-UTR片段ACCCTAATCTAGTTGTCAT突变成ACCCTAAACAACTTGTCAT，将野生型或突变型Sox63'-UTR克隆到含有荧光酶报告基因载体pmirGLO的下游，将miR-28-3p mimics与野生型Sox6的3'末端共转染到小鼠MC3T3-E1细胞中，72小时后以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对荧光素酶活性值，检测在miR-28-3p mimics存在的情况下能否导致荧光素酶活性的改变。另外还采用定量PCR和western blot方法进一步探究了miR-28-3p对Sox6表达量的影响。
　　将小鼠Sox6基因的完整cDNA克隆到pcDNA3.1/Zeo载体上，构造出可以过表达Sox6基因的pc-Sox6质粒。miR-28-3p mimics和pc-Sox6共转染进细胞，检测细胞活力、凋亡程度、凋亡相关蛋白表达水平及骨生成相关基因(Col1a1、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ)的表达水平变化。
　　我们用mimics阴性对照、miR-28-3pmimics、ASO阴性对照、ASO-miR-28-3p转染细胞，并用PI3K的抑制剂LY294002处理细胞，用免疫印迹的方法分析检测了加入抑制剂前后，参与PI3K/AKT信号通路的蛋白表达和磷酸化水平变化。
　　结果:
　　定量PCR结果显示，与正常人群对照组相比，miR-28-3p在骨折患者接受固定化治疗7天后的表达量并没有显著变化;而随着时间推移，在固定化治疗14天和21天时，其表达量有大幅度下调（P＜0.05，P＜0.01甚至P＜0.001）。这说明miR-28-3p在骨折愈合过程中的表达量是明显下调的。
　　与对照组相比，转染miR-28-3pmimics的细胞在转染后1天、2天、3天细胞活力有明显增强（P＜0.05或p＜0.01），而转染反义寡核苷酸ASO-miR-28-3p的细胞活力降低;相反地，MC3T3-E1细胞凋亡的比率在转染miR-28-3pmimics后明显被抑制(P＜0.01)，转染ASO-miR-28-3p后细胞凋亡加强。因此可以看出，miR-28-3p对成骨细胞有促增殖、抑凋亡的作用。
　　另外，转染miR-28-3pmimics的细胞中促凋亡基因Bax表达量下调、抗调亡基因Bc1-2上调。Col1a1的表达水平也明显增加，但同时也显著降低了Col-Ⅱ和Co1-Ⅹ的表达（P＜0.01或P＜0.001）。而ASO-miR-28-3p对Col1a1、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ基因表达水平的影响正好相反(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。上述结果表明，miR-28-3p增强细胞活力和Col1a1基因的表达，同时抑制细胞凋亡和Col-Ⅱ、Col-Ⅹ基因表达。
　　野生型Sox6与miR-28-3p mimics共转染可以导致荧光素酶活性大幅度降低，而ASO-miR-28-3p可以显著增加报告基因的荧光素酶活性(P＜0.01)，即miR-28-3p可以导致Sox6表达量下调;而1miR-28-3p mimics共转染不会引起突变型Sox6荧光素酶活性大幅度降低。Sox6在mRNA水平和蛋白水平上的表达量均会由于miR-28-3p mimics的转染而显著减少(P＜0.01);而转染ASO-miR-28-3p后Sox6mRNA和蛋白的表达量明显增加(P＜0.05)。综上所述，这说明Sox6可以作为miR-28-3p的靶基因，后者可以通过直接结合来抑制Sox6的表达量。
　　当miR-28-3p单独过表达时，我们观察到MCT3T-E1细胞在转染后1天、2天、3天后的增殖速率与阴性对照组相比明显提升，细胞凋亡率明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。有趣的是当共转染pc-Sox6后，miR-28-3p mimics对细胞增殖、凋亡的影响会降低（P＜0.05或P＜0.01）。促凋亡因子Bax在miR-28-3p mimics的调控下表达量减少，而抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达量上调;作为补充，ASO-miR-28-3p可以使Bax上调并使Bcl-2表达量下调。miR-28-3p对二者的影响均可以被Sox6抑制。与对照组相比，miR-28-3p过表达的MCT3T-E1细胞表达骨生成相关基因(Col1a1、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ)能力均有所改变:Col1a1表达增加(P＜0.01);而Col-Ⅱ和Col-Ⅹ表达量下调(P＜0.05)。同时转染miR-28-3p mimics和pc-Sox6可以抑制前者对成骨细胞表达上述骨生成相关基因的影响。
　　与对照组相比，miR-28-3p mimics可以上调PI3K和Akt的磷酸化水平;而ASO-miR-28-3p则相反，可以抑制二者的磷酸化。同时，miR-28-3p引起的磷酸化上调可以被PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002抑制，表明miR-28-3p可能通过激活PI3K/Akt通路在成骨过程中起作用。
　　结论:
　　本研究中对脆性骨折患者血浆的分析表明，在手部和关节内骨折愈合过程中miR-28-3p的表达水平均明显下降。这是由于:在骨折愈合初期，miR-28-3p表达量较高，这时细胞处于快速增殖阶段;随着时间的推移，成骨细胞数量快速增加，这时miR-28-3p有所下降，它调控的细胞增殖速率也随之降低，而其对细胞凋亡的抑制作用也部分被解除，于是成骨细胞总体增殖的速率有所下降;到了骨折愈合的后期，miR-28-3p的含量大幅度下降，导致成骨细胞不再快速分裂增殖，而是进一步分化成为成熟的骨细胞、软骨细胞等。
　　通过转染细胞中凋亡相关蛋白表达量的结果可以进一步验证miR-28-3pmimics能够促进细胞增殖、抑制凋亡，在骨折愈合过程中有潜在的促进作用。另一方面，Col-Ⅱ是软骨细胞分化发育成骨的过程中首先编码的蛋白，之后合成Col-Ⅹ，而Col1a1只有在成骨细胞中才会表达。实验中，Col1a1的表达水平受miR-28-3p mimics的影响而上调;而Col-Ⅱ和Col-Ⅹ的表达水平均有所下调，意味着miR-28-3p对骨折愈合有潜在的促进作用。
　　我们证实了参与细胞增殖和凋亡的Sox6转录因子是miR-28-3p的一个下游调控靶基因，它受到miR-28-3p mimics的负向调控。miR-28-3p可以在成骨细胞中通过靶向负面调节Sox6而促进细胞活力、抑制细胞凋亡、影响骨生成相关基因(Col1a1、Col-Ⅱ、Col-Ⅹ)的表达，进而解除了Sox6对miR-28-3p的负反馈抑制作用。同时，Sox6过表达可以削弱miR-28-3p mimics对细胞活力、细胞凋亡和成骨相关基因表达的影响。最后，miR-28-3p可以通过活化PI3K/AKT信号途径而加速骨折愈合过程。
　　总之，我们的实验探究了miR-28-3p加速骨折愈合的新功能，其可能的分子机制是miR-28-3p调控其下游靶基因Sox6和PI3K/Akt通路。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 引言

第一节 脆性骨折概述

第二节 小RNA-28-3p概述

1．2．1 非编码RNA简介

1．2．2 小RNA定义及作用机制

1．2．3 microRNA与疾病的关系

1．2．4 miRNA与成骨的关系

1．2．5 miRNA-28-3p简介及其与骨折愈合的关系

第三节 PI3K／AKT信号通路

1．3．2 PI3K／Akt通路与骨折愈合

第四节 本课题研究的目的意义和主要内容

第二章 miR-28-3p在骨折愈合不同时期的表达情况

2．1．1 实验材料

2．2．2 常用培养基和试剂的配制

2．2．3 实验方法

第二节 实验结果

2．2．1 骨折后患者血浆中miR-28-3p表达量随时间增加而下调

第三节 实验结果讨论

第三章 miR-28-3p可以促进细胞增殖和Col1a1的表达，同时抑制细胞凋亡和Col-Ⅱ、Col-Ⅹ基因的表达

第一节 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 常用培养基和试剂的配制

3．1．3 实验方法

第二节 实验结果

3．2．2 miR-28-3p促进Col1a1表达、抑制Col-Ⅱ和Col-Ⅹ表达

第三节 实验讨论

第四章 Sox6可以作为miR-28-3p的一个下游靶基因

4．1．1 所需试剂

4．1．2 实验所需试剂配制

4．1．3 实验步骤

第二节 实验结果

4．2．1 Sox6是miR-28-3p的一个直接下游靶点

4．2．2 Sox6能够抑制miR-28-3p对细胞增殖、凋亡以及对骨生成相关基因的影响

4．2．3 miR-28-3p可以激活PI3K／Akt信号通路

第三节 实验讨论

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文