负载BMP-2的PPLA微球的制备及评价

摘要

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床常见病。创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。临床上粉碎性骨折造成的大段骨缺损一直是外科医生的一大难题，常用的办法是自体骨移植，然而，自体骨移植不仅来源有限，而且会造成取骨区疼痛、出血。近年来，骨组织工程的研究有望解决这一问题，具诱导成骨活性的生物支架材料是骨组织工程中的一大热点。另外，一些成骨生长因子或细胞因子如骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等加入支架中可以增强骨的修复率。
　　骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)属于转化生长因子-β超基因家族，BMP-2是BMP家族中被研究的较早也是研究的最多的一种骨诱导生长因子，具有很强的诱导成骨的作用。研究表明，BMP-2作为骨折初始阶段的启动因子，可以诱导间充质细胞向骨细胞分化，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。然而，作为一种蛋白质类药物，BMP-2亦具有蛋白质类药物普遍表现出的生物稳定性差、半衰期短，进入人体内后快速随体液扩散或者被降解的特性，从而不能在期待部位发挥长效作用，无法达到预期的疗效。所以，如果将BMP-2与合适的载体相结合以制备BMP-2缓释系统，就可以避免由于BMP-2半衰期短所造成的不便，发挥其良好的诱导成骨作用。
　　近年来，使用可生物降解聚合物材料运载蛋白质，将蛋白质类药物制成微球的研究引起人们广泛的关注。生物可降解聚合物材料指的是天然或者能够通过人工合成得到的，可以在人体内通过酶解或非酶解作用降解的大分子聚合材料，其降解产物对机体无毒，且能参与机体新陈代谢或者通过正常生理途径排出体外。其中聚乳酸(PLA)由于具有良好的生物相容性、可生物可降解性、无毒性而成为常用的药物载体之一，已得到美国FDA的批准，成功应用于临床骨科及手术缝合线等领域。但因PLA中含有大量的酯键，因而其亲水性较差，为满足运载不同性质药物的要求，对PLA改性就显得尤为重要。最常见的改性方法是向PLA中引入亲水性物质聚乙二醇(PEG)，PEG具有优良的生物相容性，其安全性已经得到了美国FDA的认证。PEG的引入能在提高PLA亲水性的同时赋予PLA一些新的特性和功能，它能降低生物体内蛋白质在材料表面的吸附和细胞的黏附，从而避免在体内被免疫系统识别;它还能保护被改性的PLA不受免疫系统的破坏，且形成的两亲性共聚物具有可修饰性，如可引入端基活性基团。
　　本课题以BMP-2为模型药物，以可降解多聚物聚乳酸-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物(PPLA)作为载体材料，采用复乳溶剂挥发法成功制备了用于治疗骨缺损的BMP-2/PPLA缓释微球，并对所制备的微球进行了一系列的研究，主要包括BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究、BMP-2/PPLA微球的理化性质研究、BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究。
　　1.BMP-2/PPLA微球的处方和工艺研究
　　首先，建立BMP-2/PPLA微球药物含量测定方法，然后，以包封率为评价指标，对微球的处方和工艺因素进行单因素考察，找到对微球包封率影响最主要的四个因素;采用正交实验设计优化处方和工艺;选择合适的方法对BMP-2/PPLA微球进行干燥;最后，进行重现性试验，验证处方组成的合理性以及制备工艺的稳定性。
　　结果表明，采用超速离心、考马斯亮蓝UV法测定BMP-2/PPLA微球的包封率和载药量，精密度和回收率均高、重现性好，BMP-2在5.5～49.5μg/mL浓度范围内，吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好;通过单因素及正交试验得到最优处方为PVA浓度为4％，PPLA浓度为90mg/mL，内水相、油相体积比为1:5，油相外水相体积比为1∶10。微球重现性结果良好。
　　2.BMP-2/PPLA微球的理化性质研究
　　根据最优处方制备BMP-2/PPLA微球，通过光学显微镜及超景深显微镜观察其外观形态;通过激光粒度分析仪对所制备的BMP-2/PPLA微球的粒径、粒度分布以及Zeta电位进行研究。
　　采用复乳溶剂挥发法制备BMP-2/PPLA微球，该法制备的BMP-2/PPLA微球在光学显微镜和超景深显微镜下观察成圆整的球形，平均粒径为（3.74±0.45）μm，Zeta电位平均值为（-23.27±0.76）mv，包封率为（79.80±0.06）％。
　　3.BMP-2/PPLA微球的体外释药性研究
　　首先，建立了BMP-2/PPLA微球体外释放度的测定方法并进行了方法学考察;然后，采用动态膜透析法，以pH4.0的醋酸盐缓冲液为释放介质，以BMP-2溶液为对照，测定不同时间点BMP-2/PPLA微球的体外释药情况，绘制释放曲线，考察BMP-2/PPLA微球的体外释药规律。
　　结果表明，所建立的BMP-2/PPLA微球含量测定方法，精密度高、准确度高、稳定性好，在0.55～11μg/mL浓度范围内，吸光度与BMP-2浓度的线性关系良好，符合含量测定要求。体外释放试验结果表明，BMP-2原料在释放介质中释放较快，仅需50分钟累积释放百分率就达89.34％;BMP-2/PPLA微球制剂可长期稳定释放，3天的累积释放百分率达40％，第12天累计释放百分率达到85％，缓释效果较好。

目录

声明

摘要

前言

第一章 BMP-2／PPLA微球的处方和工艺研究

1 材料

2．2 BMP-2／PPLA微球包封率和载药量的测定方法

2．4 BMP-2-PPLA微球处方和工艺的单因素考察

2．5 正交试验设计优化处方与工艺

2．6 重现性实验

3 结果

3．1 BMP-2／PPLA-MS药物含量测定方法考察结果

3．2 BMP-2-PPLA微球处方和制备工艺单因素考察结果

3．3 正交设计优化BMP-2／PPLA-MS处方与工艺结果

3．4 重现性试验结果

4．讨论

5．小结

第二章 BMP-2／PPLA微球的理化性质考察

2．1 BMP-2／PPLA微球的理化性质表征

3 实验结果

3．1 外观性状和表面形态观察

3．2 粒径、粒度分布及Zeta电位测定结果

4 讨论

5 结论

第三章 BMP-2／PPLA微球的体外释药性及初步稳定性研究

1 实验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

2 实验方法

2．1 BMP-2／PPLA微球体外释药考察

2．2 BMP-2／PPLA微球体外释放方法学考察

3 结果

3．1 BMP-2／PPLA微球体外释放度方法学考察结果

3．2 BMP-2／PPLA微球体外释放度测定结果

4 讨论

5 结论

总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文