山东地区产NDM大肠埃希菌分子特征和传播机制研究

摘要

目的:
　　1.了解CREC药物敏感性，进行菌株的表型筛选及同源性分析。
　　2.研究我院产NDM菌株在CREC中流行情况及耐药基因的可传播性。
　　3.研究大肠埃希菌毒力因子与系统性进化分型、耐药基因的相关性。
　　4.建立使用飞行时间质谱技术快速检测产碳青霉烯酶菌株的方法。
　　方法:
　　1.菌株收集收集山东省立医院2015年1月至12月，临床分离的CREC菌株（患者来自全省各个地区），保存有菌种的共23株。另外，收集碳青霉烯类敏感的大肠埃希菌20株，作为质谱检测产碳青霉烯酶菌株的阴性对照。采用梅里埃VITEK Compact和梅里埃基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对菌种进行确认。
　　2.表型筛选与药敏试验对CREC菌株进行表型筛选实验，包括改良Hodge试验(MHT)、ETP-EDTA双纸片协同试验、ETP-EDTA复合纸片试验、改良碳青霉烯酶失活试验(mCIM)。对确认为CREC的菌株进行微量肉汤稀释法和E-test法药物敏感性实验，敏感性判断标准为(Clinical and Laboratory StandardsInstitute, CLSI M100-S26)。
　　3.同源性分析对CREC菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)试验和多位点序列分析(MLST)，分析菌株的同源性。PFGE:将菌体基因组DNA包埋于小胶块内，进行胶块内细胞裂解、XbaⅠ酶切、脉冲场凝胶电泳，使用Bionumerics软件对电泳指纹图谱进行比对，分析菌株的同源性，研究菌株克隆传播的情况。MLST:煮沸法提取菌株基因组DNA，扩增七个管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)，测序后将序列信息录入MLST网站(http://www.MLST.net/)，获得相应的等位基因号码，再根据7个等位基因的组合，获得菌株ST型。采用eBURST软件对菌株进行聚类同源性分析，MEGA6软件对菌株的系统性进化进行分析。
　　4.耐药基因检测对23株CREC菌株进行了耐药基因PCR扩增和测序，了解NDM及其他耐药基因在CREC中的流行情况，对于碳青霉烯类耐药基因扩增阴性菌株，提取细菌外膜总蛋白，进行SDS-PFGE蛋白电泳，分析膜孔蛋白缺失情况。
　　5传播机制检测对20株产NDM的CREC菌株进行了质粒接合转移实验和电转化试验检验耐药基因是否可以通过质粒在菌株间水平传播，并对接合子进行了肉汤稀释法和E-test法药物敏感性试验来分析质粒的耐药性。
　　6.系统性进化分群与毒力因子检测按照Clermont建立的方法，通过PCR扩增（ChuA、YjaA、TspE4C2）将CREC菌株进行系统性进化分群。同时进行多重PCR扩增常见肠外感染大肠埃希菌毒力因子（PAI、papA、fimH、kpsMTⅢ、papEF等共31个基因），采用SPSS软件，对菌株MLST分型、ESBLs基因型、NDM型与致病因子的相关性进行Fisher's精确检验。
　　7.质谱检测采用CHCA作为小分子量参照物，对梅里埃微生物鉴定质谱仪VITEK MS进行定标。厄他培南作为底物，与临床菌株作用后检测厄他培南质谱峰图改变，建立质谱快速检测碳青霉烯酶产酶菌株的方法学，并对其特异性和敏感性进行评价。
　　结果:
　　1.2015年全院共分离出大肠埃希菌1575株，其中碳青霉烯类耐药大肠埃希菌38株（约占2.4％），分别来自尿液47.2％(20/38)、痰18.9％(7/38)、创面分泌物11.3％(4/38)、腹腔标本15.79％(6/38)、血液3.8％(1/38)。CREC主要来自泌尿外科26.3％(10/38)，15.8％(6/38)来自儿科，15.8％(6/38)来自ICU。保存有菌株的有23株（其中一株来自同一患者的不同感染部位）。22位患者中有7位明确使用过碳青霉烯类抗菌药物，除了一位患者以外都有过侵入性操作（放置引流管、气管切开、静脉置管、留置导尿管等）。
　　2.所有菌株均对头孢菌素类、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢西丁、氟喹诺酮类全部耐药，并且耐药水平较高，MIC值均≥128μg/ml;23株菌株中仅一株对氨曲南敏感。但所有菌株对替加环素、多粘菌素B均为敏感。对阿米卡星的敏感性也较高，23株中仅4株耐药，庆大霉素耐药率为47.82％(11/23)。值得关注的是，磷霉素耐药率为30.43％(7/23)。
　　3.23株菌株中共有20株NDM基因阳性，CTX-M和TEM为最常见的ESBLs基因，对扩增的片段测序以确定具体CTX-M基因亚型和TEM基因亚型。19株TEM阳性菌株全部为TEM-1型。最常见的CTX-M亚型为CTX-M-14，共13株;其次为CTX-M-15，共检出6株，CTX-M-55共检出6株。其中16株携带两种以上ESBLs基因，6株携带两种CTX-M亚型基因。4株阿米卡星耐药菌株均由16S rRNA甲基化引起。23株临床菌株全部对喹诺酮类药物耐药，18株喹诺酮耐药基因阳性，9株为qnrB基因，8株为qnrS基因，7株为qnrS和aac(6')-Ib-c同时阳性，其余5株可能为其他机制导致的喹诺酮类耐药。7株磷霉素耐药菌株全部由fosA3基因引起。
　　4.按Tenover标准，采用相似度80％为cut-off值，23株CRE可以分为11个亚群，其中一个亚群中3株菌相似度大于90％，提示存在克隆菌株流行。
　　5.23株临床分离的CREC中含有1-6个质粒不等，15株携带50 kb大小左右的质粒，11株同时携带80 kb、50 kb左右两个质粒（其中7株为ST167，2株为ST410，1株为ST5229，1株为ST405）。质粒接合转移试验共获得携带碳青霉烯耐药基因质粒接合子17株。产碳青霉烯酶的菌株中3株菌不能通过质粒接合转移试验获得对碳青霉烯类耐药的接合子，或者通过电转化试验获得转化子。对本实验中接合子对喹诺酮类全部为敏感，证明喹诺酮类耐药基因与NDM耐药基因不在同一个质粒上。
　　6.23株临床菌株没有检出高致病力B2群，但3株属于致病力较强的D群（3株均为ST405型），16株属于B1群（7株为ST167型，3株为ST410型，2株为ST617型，ST361、ST5229、ST744各有一株），4株属于A群（3株为ST167型，1株为ST617型）。A群和B1群ST167菌株的PFGE指纹图谱有所不同，可能为不同来源菌株。产NDM-1菌株比产NDM-5菌株中papGⅢ携带率高。ST617与ST405比ST167携带papGⅢ的比例高，有更强的粘刚、定植的能力。
　　7.厄他培南作为底物，采用飞行时间质谱技术检测NDM型碳青霉烯酶产酶株CREC特异性和敏感性均为100％。
　　结论:
　　1.我院CREC发生率约为2.4％，与全国CREC检出率基本一致。泌尿外科、儿科、ICU是CREC流行主要科室;尿液、腹腔标本（胆汁、腹水）、痰是耐药菌的主要来源。侵入性操作、使用过头孢菌素或碳青霉烯类药物是耐药菌发生的高危险因素。CREC菌株通常是多重耐药菌，但对替加环素、多粘菌素B全部敏感，阿米卡星也有较好的敏感性。本实验筛选出一株菌株磷霉素耐药基因与NDM基因在同一个可传播质粒上。磷霉素作为CREC选择性治疗药物时要慎重，这类泛耐药菌株的传播将给临床治疗带来更大的挑战，应加强筛查和控制。
　　2.NDM是我院引起CREC的主要因素，最常见的NDM亚型为NDM-5，约占52％(12/23)，其次为NDM-1(6/23)，这区别于国内其他地区以NDM-1为主的流行情况。ST167是我院CREC主要流行株，也是NDM-5的主要携带者。另外检出ST617、ST405、ST410等6种ST型。除了NDM基因，CREC通常还携带喹诺酮、氨基糖苷等多种耐药基因。TEM-1和CTX-M-14是我院最主要ESBLs基因型，其次为CTX-M-15。大部分菌株同时携带两种以上ESBLs基因，对β-内酰胺类药物有较强的水解能力。
　　3.我院既存在耐药菌株的克隆传播，又存在耐药质粒的水平传播，质粒水平传播过程中存在耐药基因的整合。IncX3型质粒是携带NDM基因的主要载体，也有少量IncFⅡ、ncFⅡr型质粒的检出。大部分质粒为50 kb大小，其余70-130kb大小不等。具有可兼容其他质粒的特点，容易在菌株间水平传播，且该质粒能够在临床菌株中稳定存在。以往认为，CREC较少引起暴发、流行，关注度比较低。但本实验证实，IncX3质粒容易传播，可能造成CREC发生率升高，甚至流行，应加强携带这类质粒菌株的筛查和监控。
　　4.我院CREC未检出高致病性B2群菌株，但检出相对高毒力的D群菌株3株，本研究第一次报道了我国携带NDM的D群大肠埃希菌ST405菌株。粘多糖、P菌毛、M菌毛、铁转运蛋白在大肠埃希菌粘附、定植和致病力增强中起了重要作用。
　　5.厄他培南作为底物，采用飞行时间质谱技术检测产碳青霉烯酶菌株具有较好的敏感性和特异性，在临床开展应用具有良好的前景。

目录

声明

摘要

符号及英文说明

第一部分 碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的筛选及药敏试验

材料与方法

结果

讨论

第二部分 碳氢霉烯类药物耐药大肠埃希菌同源性分析

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 产NDM菌株分子特点及耐药基因传播性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第四部分 大肠埃希菌毒力因子研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第五部分 质谱技术在检测产碳青霉烯酶菌株中的应用

结果

讨论

附录

课题创新性

参考文献

综述 碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌研究进展

致谢

论文发表情况

学位论文评阅及答辩情况表

英文文章一

英文文章二