玉米泛素受体ZmDA1、ZmDAR1对籽粒发育的影响

摘要

玉米是当今世界总产量最高的农作物之一，是重要的粮食和饲料来源，同时还是工业原料。由于世界人口的持续增加和耕地面积的不断减少及环境变化，玉米的需求将继续增加，如何提高单位面积的玉米产量仍是一个重要而且被广泛关注的课题。玉米产量是单位面积果穗数、穗粒数和粒重协调发展的结果，而这些性状也是受到诸如:遗传因素、激素水平和环境因子等多方面控制。人们可从多层面尝试提高玉米产量，但寻找调控作物产量的相关基因，研究它们的作用机制是提高玉米育种水平的关键。通过转基因育种的方式对调控产量性状的基因进行利用，已经成为现代作物育种的必然趋势。本工作以玉米两个泛素受体ZmDA1、ZmDAR1为研究对象，利用转基因和突变体材料研究目标基因功能并探讨它们在调节玉米籽粒发育中的作用机制。
　　ZmDA1、ZmDAR1是拟南芥AtDA1、AtDAR1在玉米中的同源基因
　　DA1蛋白最早是由李云海等在拟南芥中报道的，是一个能够调控器官大小的泛素受体。AtDA1隶属于拟南芥中的一个小的基因家族，在拟南芥的生长发育中扮演着重要角色，生化功能是通过其肽酶活性切割与其相结合的底物。AtDA1对拟南芥的器官和种子大小起负调控的作用。当其氨基酸序列中358位保守的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)后，会出现da1-1表型。da1-1突变体的器官和种子比野生型都显著增大。AtDAR1在拟南芥中与AtDA1亲缘关系最近，同样存在保守的精氨酸位点，突变体出现器官和种子增大的表型，且与AtDA1存在功能冗余。
　　通过生物信息学分析表明，玉米中存在6个与拟南芥DA1基因家族成员序列相似的蛋白，玉米DA1家族的所有成员与拟南芥AtDA1、AtDAR1和AtDAR2在蛋白质二级结构上具有高的相似性，都含有两个UIM结构域、一个LIM结构域和一个位于C-端的DUF3363结构域。其中GRMZM2G017845和GRMZM2G099328编码蛋白与拟南芥AtDA1、AtDAR1序列相似度较高，分别在333位和322位存在保守的精氨酸位点，将其分别命名为ZmDA1、ZmDAR1。根据表达谱分析发现，与AtDA1、AtDAR1相似，ZmDA1和ZmDAR1在玉米中广谱表达，ZmDA1在早期叶片、穗位叶和未成熟的雄、雌穗中表达强度高;ZmDAR1主要在DAP10-15的胚乳中表达强度高。
　　过量表达Zmda1、Zmdar1能够提高玉米籽粒产量
　　以玉米B73cDNA为模板克隆ZmDA1、ZmDAR1，通过定点突变使ZmDA1蛋白333位的精氨酸(R)突变为赖氨酸(K)，ZmDAR1蛋白322位精氨酸变为赖氨酸。将野生型基因和突变型基因分别插入植物表达载体，通过农杆菌介导的茎尖转化法分别导入玉米优良自交系DH4866，经过除草剂抗性筛选和分子检测，确定目的基因已经整合到玉米基因组中。
　　观察营养生长期的转基因纯合系植株，发现在株型、株高、叶片大小等方面与对照材料相比，并没有出现显著差异。当植株进入散粉期，突变型基因过表达材料具有更为发达的雌性穗，但株型、株高、穗位高等性状在不同株系间未出现显著差异。经过连续三年的田间产量测定实验得出:在玉米中过量表达Zmda1或Zmdar1基因能够提高玉米产量。Zmda1过表达材料果穗长度由对照的14.3cm增长至15.3-15.8cm;Zmdar1过表达材料果穗增长至14.6-15.8cm;果穗的增长伴随着行粒数增加。Zmda1、Zmdar1转基因材料的籽粒大小和重量也高于非转基因对照。由于穗粒数和百粒重增加，突变型基因过表达材料的小区产量分别增加了15-22％和18％-22％。与之相反的是野生型ZmDA1、ZmDAR1的过表达材料，果穗变短、百粒重减少，小区产量下降。即在玉米中过量表达Zmda1、Zmdar1基因能够通过增加籽粒重量和穗粒数提高玉米产量。而拟南芥中da1-1突变引起器官和种子均比野生型显著增大。
　　ZmDA1、ZmDAR1对糖类运输和淀粉合成的影响
　　对于单子叶作物而言，胚乳重量对产量起到了决定性作用。而淀粉是胚乳的重要组分。测定转Zmda1、Zmdar1基因材料的籽粒淀粉含量得出，其淀粉含量与野生型对照相比显著增加，转Zmda1基因材料增加约11％，转Zmdar1基因材料增加约14％。对授粉后12天的籽粒石蜡切片进行淀粉粒染色，发现转Zmda1、Zmdar1基因的籽粒积累更多的淀粉颗粒，显示出在转突变型基因籽粒中淀粉合成速率提高。使用半定量PCR和实时定量PCR检测淀粉合成途径中的相关基因得出，ZmGBSSI和ZmBt2在转Zmda1和Zmdar1材料中表达水平显著提高。而在转ZmDA1、ZmDAR1基因籽粒中，ZmGBSSI和ZmBt2表达水平下调。这些结果表明ZmDA1、ZmDAR1能够影响玉米籽粒的淀粉合成。
　　利用扫描电镜观察不同株系籽粒的粉质胚乳区的淀粉粒形态发现，转Zmda1、Zmdar1基因籽粒中淀粉粒形态更加规则，但颗粒大小差异大。测量淀粉粒直径并将其分为大、中、小三组，与野生型对照相比，转Zmda1、Zmdar1基因籽粒中大颗粒组的淀粉粒数目显著减少、而中颗粒组和小颗粒组的淀粉粒显著增多，胚乳淀粉颗粒平均直径降低。较小的淀粉颗粒能够增加淀粉颗粒表面积，方便一系列淀粉合成酶的附着，这种胚乳淀粉颗粒的形态变化与淀粉合成速率的增加相对应。
　　糖类物质在籽粒发育过程中扮演重要角色，在籽粒发育早期既作为信号物质调控一系列基因的表达，又作为能源物质保障籽粒的发育;在籽粒发育后期可溶性糖作为淀粉合成的前体物质影响着籽粒淀粉合成及积累的速率。从可溶性糖含量来看，转Zmda1、Zmdar1基因材料籽粒在授粉前10天具有较高的可溶性糖水平，可能有利于细胞增殖;而ZmDA1、ZmDAR1转基因籽粒在发育早期的可溶性糖水平一直低于野生型对照和转Zmda1、Zmdar1基因的，但在发育后期可溶性糖含量较高，推测是淀粉合成较慢所致。
　　ZmDA1、ZmDAR1突变对玉米传递细胞发育的影响
　　以ZmDA1为钓饵，筛选授粉后10天的玉米籽粒cDNA文库，得到了玉米葡萄糖转运蛋白ZmS WEET4c，Co-IP实验确定了后者是ZmDA1的结合蛋白。在玉米籽粒发育早期，ZmSWEET4c负责向籽粒转运葡萄糖，并调控传递细胞的发育。较高浓度的葡萄糖还会刺激细胞增殖。联系之前的突变体基因过表达材料籽粒早期可溶性糖含量升高的现象，推测在ZmDA1、ZmDAR1突变体租转突变型基因材料中传递细胞的发育和胚乳细胞的数量可能会发生变化。因此，挑选了DAP3、8和15的籽粒材料进行切片观察。在转Zmda1、Zmdar1基因材料中，相比Zm A1、ZmDAR1转基因材料和非转基因对照，Zmda或Zmdar1过表达材料的胚发育进程加快，传递细胞更为发达。ZmDA1、ZmDAR1突变体也表现同样的变化。与此一致的是传递细胞发育的关键调控因子ZmMRP1在突变型基因过表达材料中显著上调表达。这些结果表明在ZmDA1、ZmDAR1参与的玉米籽粒发育调控中，传递细胞的发育可能受到ZmDA1或ZmDAR1结合蛋白或底物的直接调控。更为发达的传递细胞，能够向胚乳中转运更多的养分，这些养分一方面促使籽粒变大，另一方面保障了那些位于果穗顶端且营养供应不足籽粒的正常发育，从而提高了果穗籽粒数和籽粒重。
　　ZmDA1与ZmDAR1的生物学功能相似但不完全相同
　　ZmDA1和ZmDAR1蛋白具有相似的蛋白结构，且都能通过影响传递细胞发育和淀粉合成来调节玉米籽粒大小，但二者在表达谱和调节方式上又存在些许差异。ZmDA1主要在叶片和未成熟的雄穗、雌穗以及幼胚中表达;而ZmDAR1主要在授粉后10天和15天的籽粒中表达。有可能ZmDAR1主要在胚乳中发挥功能而ZmDA1主要在迅速生长的器官起作用。根据连续三年田间试验得出，相比Zmda1转基因材料和DH4866对照，Zmdar1过表达转基因材料具有更多的穗粒数和更高的淀粉含量，展示出更好的田间产量。在检测淀粉合成途径中相关基因的表达水平时发现，ZmGBSSI和ZmBt2在Zmdar1转基因材料中的上调表达程度高于Zmda1转基因材料，这不仅能够部分解释Zmdar1转基因材料淀粉含量更高的现象，而且也支持ZmDAR1在玉米胚乳发育过程中扮演着更重要角色的推测。
　　利用ZmDA1和ZmDAR1分别为钓饵的酵母双杂交的筛选中，虽然筛选出数量较多的可互作选蛋白，但只筛选到2个既能与ZmDA1互作又能够与ZmDAR1互作的蛋白，一个是翻译延伸因子EF1-αlike，另一个是玉米天冬酰胺酶ZmASPGB1。这表明它们能够与多种蛋白互作，可具有共同的底物，参与同一代谢途径的调控。由于互作蛋白的多样性，ZmDA1和ZmDAR1也可能存在着不同的调控路径。
　　总而言之，本论文将克隆得到的玉米DA1、DAR1、da1、dar1基因分别转入玉米骨干自交系中。田间测试表明转Zmda1和Zmdar1基因能够降低转基因玉米果穗的秃尖程度，提高行粒数进而影响穗粒数，转基因株系籽粒的百粒重也显著增加;后续实验表明，粒重的增加是由于淀粉含量提高所导致的。通过酵母双杂交实验与Co-IP实验发现ZmDA1能够与己糖转运体ZmSWEET4c相互作用，推测ZmDA1能够调控ZmSWEET4c的降解，进而影响传递细胞发育、籽粒中的养分输入和淀粉积累。这为对了解泛素蛋白酶系统在糖转运和籽粒发育过程中发挥的作用提供了重要线索。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 世界粮食供给现状需要强化玉米研究

1．2 玉米籽粒的发育

1．2．1 玉米胚的发育

1．2．2 玉米胚乳的发育

1．3 植物种子大小的调控

1．3．1 细胞增殖对于种子大小的调控

1．3．2 细胞扩张对种子大小的调控

1．4 泛素-蛋白酶系统参与种子大小的调控

1．4．1 泛素受体在调控植物种子大小及发育中的作用

1．4．2 泛素连接酶在调控种子大小中的作用

1．5 种子发育中的糖转运及代谢调控

1．6 本研究的目的与意义

第二章 Zmda1、Zmdar1对玉米生长发育和产量的影响

2．1 材料方法

2．1．1 植物材料、质粒、菌株和工具酶

2．1．2 生物信息学分析

2．1．3 ZmDA1、ZmDAR1的表达模式分析

2．1．4 转基因玉米植株的获得

2．1．5 转基因材料的分子鉴定

2．1．6 转基因材料的表型观察

2．1．7 转ZmDA1、ZmDAR1及突变型基因材料的籽粒淀粉及可溶性糖含量的测定

2．1．8 Zmda1、Zmdar1影响玉米传递细胞发育的观察

2．1．9 转基因株系籽粒中相关基因的表达检测

2．1．10 数据处理方法

2．2 结果与分析

2．2．1 玉米DA1基因家族的生物信息学分析

2．2．2 玉米DA1和ZmDAR1基因的表达模式分析

2．2．3 转基因材料的获得

2．2．4 转基因对玉米营养生长期表型的影响

2．2．5 转Zmda1、Zmdar1基因对玉米生殖生长的影响

2．2．6 Zmda1、Zmdar1基因影响玉米籽粒淀粉合成及淀粉粒形态

2．2．7 Zmda1、Zmdar1基因影响玉米籽粒传递细胞的发育

2．3 讨论

第三章 ZmDA1、ZmDAR1调控玉米种子大小的机理研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 植物材料

3．2．2 突变体的鉴定

3．2．3 突变体表型鉴定

3．2．4 玉米籽粒cDNA文库的构建

3．2．5 酵母双杂交筛选互作蛋白

3．2．6 互作蛋白的验证

3．2．7 转ZmDA1-GFP、ZmDAR1-GFP融合基因材料的产生

3．3 结果分析

3．3．2 ZmDA1、ZmDAR1突变体的分子检测

3．3．3 ZmDA1、ZmDAR1突变体的表型变化

3．3．4 突变体籽粒的组织学观察

3．3．5 ZmDA1、ZmDAR1互作蛋白的筛选

3．3．6 与ZmDA1互作蛋白的验证

3．3．7 ZmDA1-GFP融合基因转基因材料的产生

3．4 讨论

3．4．2 ZmDA1和ZmDAR1的结合蛋白是复杂多样的

3．4 ，3 ZmDA1和ZmDAR1可能影响玉米氮代谢

3．4．4 ZmDA1和ZmDAR1对粒重的影响主要发生在淀粉积累阶段

3．4．5 玉米ZmDA1、ZmDAR1的突变体与转Zmda1、Zmdar1基因材料存在表型差异

第四章 总结和展望

参考文献

附图

附表

致谢

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