RbAp48通过Wnt/β-catenin信号通路调控子宫内膜腺癌细胞的增殖迁移侵袭

摘要

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)又称为子宫体癌，常见于围绝经期及绝经后老年女性，在临床诊治中主要以来自于子宫内膜腺体的腺癌最为常见，故又广泛的被统称为子宫内膜样腺癌。近年来对国内外子宫内膜癌的流行病学数据统计研究显示:在欧美等国家及大陆地区，子宫内膜癌每年新发病病例已经超过宫颈病变，居女性生殖系统恶性肿瘤发病第一位，且随着年青女性病例的不断检出，子宫内膜癌的发病逐年呈现年青化的趋势。
　　根据子宫内膜癌的病理特点及其临床诊疗特征，可将其大致分为两种亚型:Ⅰ子宫内膜样腺癌(EEC)，病变主要起源于增生的子宫内膜组织，其主要的发病机制与女性患者血液循环系统内高水平雌激素长期刺激而无孕激素的拮抗有关，与Ⅱ型相比，EEC常见于围绝经期女性及年青女性，其主要的病理类型包括高-中分化的子宫内膜腺癌以及少量粘液性腺癌及部分低分化腺癌，其分子机制涉及PTEN、K-ras、CTNNB1等基因的突变以及与DNA错配修复基因导致的微卫星灶不稳定(MSI)相关，Ⅰ型肿瘤细胞分化程度较好，肿瘤细胞的转移侵袭能力较弱，患者的病情进展比较缓慢，Ⅰ型患者术后无瘤生存期长。
　　Ⅱ型EC又称为非子宫内膜样子宫内膜癌，约占子宫内膜癌总发病例数的五分之一，病变常见于绝经后萎缩的子宫内膜，以细胞分化程度较差的浆乳癌，透明细胞癌以及腺鳞癌为主，与女性雌孕激素的水平无明显相关性，多发于绝经后老年女性，Ⅱ型患者临床诊断时多处于临床晚期，病人多处器官已存在癌灶的转移，在现阶段的诊疗水平下，约二分之一的病人术后五年内出现肿瘤的复发，并最终导致患者的死亡。Ⅱ型子宫内膜癌分子生物表型的改变以TP53和P16以及Her2/neu、Nrf2基因的突变。为主。
　　肿瘤标志物在肿瘤筛查治疗、病情监测评估以及患者预后判断等临床中有着极其重要的运用价值，CA125作为子宫内膜癌诊断的血清肿瘤标志物，已经广泛应用于临床，但是由于子宫内膜炎以及子宫腺肌症等多种子宫内膜上皮的良性疾病同样会引起血液循环系统内CA125的异常升高，导致其在子宫内膜癌诊断中缺乏特异性。免疫组化指导下的子宫内膜癌分子分型可以更好的反映肿瘤的生物学行为，能促进子宫内膜癌患者个体化、精准化治疗，如PTEN、TP53分型。现阶段临床血液生化指标及病理免疫组化指标，已经远远不能满足子宫内膜癌临床诊治需要，因此寻找新的血液生化标志物及分子分型指标显得尤为紧迫。
　　RbAp48(retinoblastoma binding protein4)是一种与多种疾病相关的核表达蛋白。RbAp48作为多种染色质装配、重塑和核小体修饰复合物的组分，可通过改变染色体及组蛋白的构象，直接调控多种有关细胞增殖分化基因的转录或直接与某种转录因子相结合（E2F、CREB、NF-κB、ER等）通过改变其活性影响基因的转录表达。大量文献数据报道:RbAp48蛋白与多种肿瘤的发生发展及其预后密切相关，如乳腺癌、肝癌等，但迄今为止其在子宫内膜腺癌增殖转移侵袭中的作用还尚未见报道。
　　Wnt/β-catenin信号通路在人类胚胎早期器官分化、细胞迁移，组织修复再生中起到重要的调控作用。文献数据研究显示:子宫内膜癌的发生与经典的Wnt/β-catenin信号通路的异常激活密切相关，子宫内膜癌样腺癌患者PTEN基因突变，可导致β-catenin降解复合体（GSK-3β/APC等）合成减弱，β-catenin蛋白出现了胞质的累积及核移位。除PTEN基因突变失活因素外，子宫内膜癌样腺癌患者还往往存在编码β-catenin蛋白的CTNNB1基因突变，上述两种途径中胞质中异常累积的β-catenin蛋白可与胞膜E-cadherin发生解离移位，与胞核内TCF/LEF蛋白家族结合，致使经典Wnt/β-catenin信号通路信号下游的靶基因c-myc、cyclinD1以及EMT上游的转录调节因子等出现过表达，诱导了正常细胞的无限增殖及去分化及细胞形态的改变，进而导致肿瘤的细胞产生及游走。最新研究数据显示:雌激素可能作为基因突变的诱导剂也可以影响Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。
　　研究目的：
　　探究RbAp48蛋白与Wnt/β-catenin信号通路的作用及RbAp48是否该通路调控子宫内膜腺癌细胞的增殖迁移侵袭
　　研究方法：
　　1.免疫组化(IHC)检测RbAp48及β-catenin在子宫内膜癌灶及配对癌旁组织中表达情况
　　2.建立RbAp48的慢病毒干扰序列感染KLE、Ishikawa细胞，建立其低表达子宫内膜腺癌细胞系(KLE、ISK)
　　3.检测慢病毒介导形成的RbAp48低表达细胞系(KLE、ISK)增殖能力的变化
　　4.检测慢病毒介导形成的RbAp48低表达细胞系(KLE、ISK)迁移及侵袭的能力的变化
　　5.探索下调RbAp48蛋白与子宫内膜腺癌细胞上皮-间质转化之间(EMT)的关系
　　6.构建RbAp48低表达的裸鼠荷瘤模型，模拟体内子宫内膜腺癌细胞的生存环境进一步探究RbAp48表达在子宫内膜癌增殖的作用
　　7.探索RbAp48蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及信号通路中蛋白表达的变化
　　研究结果：
　　1.与配对癌旁组织相比，RbAp48及β-catenin蛋白在子宫内膜癌灶组织中表达均明显升高，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)，且随着子宫内膜癌病肿瘤细胞分化程度降低表达逐渐增强。
　　2.与对照组相比，慢病毒介导形成的RbAp48低表达子宫内膜癌细胞系其增殖迁移及侵袭能力明显明显受到抑制(P＜0.05)
　　3.慢病毒介导的RbAp48低表达后，子宫内膜腺癌上皮表型蛋白E-cadherin表达增强，EMT上游转录调控因子:Snail、Twist以及间质表型蛋白及N-cadherin、Vimentin表达明显下调，子宫内膜腺癌细胞的上皮-间质转化过程(EMT)受到抑制。
　　4.裸鼠荷瘤实验:慢病毒介导的RbAp48低表达后，子宫内膜腺癌肿瘤生长速度减慢，成瘤组织体积小，重量轻。
　　5.慢病毒介导的RbAp48蛋白低表达后，Wnt/β-catenin信号通路中下游靶基因β-catenin、c-myc、cyclinD1在mRNA水平及蛋白水平的表达均明显下调，Wnt/β-catenin信号通路受到抑制
　　研究结论：
　　1.下调RbAp48抑制了子宫内膜腺癌细胞增殖能力，其具体的分子机制可能与经典的Wnt/β-catenin信号通路激活有关。
　　2.下调RbAp48逆转了子宫内膜癌细胞的上皮间质转化从而抑制了子宫内膜腺癌细胞的转移侵袭，其具体的分子机制可能与经典的Wnt/β-catenin信号通路下游的Snail、twist下调有关。

目录

声明

摘要

符号说明(按英文字母先后排序)

前言

材料与方法

一、实验材料

三、统计学处理

实验结果

二、下调RbAp48蛋白表达抑制子宫内膜癌细胞的增殖迁移及侵袭能力

三、下调RbAp48蛋白表达抑制子宫内膜癌肿瘤细胞体外肿瘤的形成

四、RbAp48促进Wnt／β-catenin信号通路靶基因的激活

讨论

实验结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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