L-赖氨酸对铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa抑制作用的研究

摘要

水体富营养化引发了蓝藻大面积爆发性繁殖，严重影响着水域生态系统，威胁人类的健康生活，控制蓝藻的生长是治理水体富营养化过程中亟待解决的问题。L-赖氨酸是微生物生长的必需氨基酸之一，对微囊藻具有显著的抑制效果。本论文以水华藻铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）为研究对象，考察L-赖氨酸对M.aeruginosa的影响，并研究L-赖氨酸的作用机理。通过对M.aeruginosa NaRes975进行全基因组测序，筛选参与胞外多糖合成和第二信使环二鸟苷酸代谢的基因，进行转录活性及蛋白表达研究，探索藻细胞应答L-赖氨酸作用的分子调控机制。主要研究内容和结果如下:
　　(1)从细胞形态结构、生理、代谢、分子调控多方面考察L-赖氨酸对M.aeruginosa的影响。研究结果表明，当浓度≥5.0mg/L时，L-赖氨酸对M.aeruginosa抑制效果显著，但M.aeruginosa FACHB-905比M.aeruginosaNaRes975需要更长的处理时间。在作用时间长于2天、浓度＞0.5mg/L时，L一赖氨酸能够抑制蛋白质和叶绿素a的积累，破坏细胞的光合作用系统。在3.0-8.0mg/L L-赖氨酸作用1天时，O2-、MDA含量和SOD活性增加，表明L-赖氨酸可能会诱导蓝藻细胞发生严重的氧化应激反应。此外，L-赖氨酸可促进M.aeruginosa NaRes975多糖的合成。同时，3.0mg/L L一赖氨酸处理3天后，多糖合成酶基因的转录活性上调。这些结果表明微囊藻细胞启用不同机制抵抗L-赖氨酸带来的损伤。当L-赖氨酸的浓度高于3mg/L、作用3天后，M.aeruginosa细胞形态被严重破坏。此外，L-赖氨酸对不同藻种作用效果表明，L-赖氨酸对铜绿微囊藻和鱼腥藻具有较好的抑制效果，藻株不同抑制效果不同。用L-赖氨酸处理产藻毒素藻株M.aeruginosa FACHB-905，当L一赖氨酸浓度为3.0mg/L时既能抑制藻细胞生长又能降低胞外藻毒素的生成。
　　(2)M.aeruginosa NaRes975全基因组的测序。基因组测序采用二代测序Illumina平台完成，测序结果已上传至GenBank，检索号为MOLN00000000。测序结果表明，M.aeruginosa FACHB-905基因组大小为5，117，533bp，G+C含量为42.4％，可预测到的编码基因个数为5，152。
　　(3)多糖合成酶基因和环二鸟苷酸(c-di-GMP)代谢酶基因的克隆及异源表达。本文通过PCR扩增技术分别对多糖合成酶基因及环二鸟苷酸代谢酶基因进行克隆，以pET-32a(+)为载体成功构建了重组质粒，并在Escherichia coli BL21(DE3)和Rosetta gamiTM2(DE3)plysS中进行异源表达。SDS-PAGE结果显示，多糖合成酶基因在不同的IPTG浓度和培养温度下未成功诱导表达目的蛋白。c-di-GMP代谢酶基因在大肠杆菌中表达经过IPTG浓度、温度和诱导时间的优化，所表达出的蛋白仍然是以包涵体的形式存在于细胞破碎沉淀中。
　　综上所述，本论文通过研究L-赖氨酸对M.aeruginosa的抑制作用，探讨了L-赖氨酸的溶藻机理，为L-赖氨酸的潜在应用提供了理论基础，拓展了控制和消除蓝藻水华的方法。另外通过对M.aeruginosa在基因组水平考察多糖合成和环二鸟苷酸代谢的相关基因，探讨L一赖氨酸作用下M.aeruginosa细胞应答的分子调控机制，为环二鸟苷酸在蓝细菌中的信号调节作用提供实验证据。

目录

声明

摘要

1．1 蓝藻水华的治理

1．2 氨基酸抑制蓝藻的研究进展

1．3 蓝藻胞外多糖和环二鸟苷酸的研究现状

1．3．1 蓝藻胞外多糖的研究现状

1．3．2 环二鸟苷酸的研究现状

1．4 本论文研究的目的、内容及意义

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究意义

第二章 L-赖氨酸对M．aeruginosa NaRes975的溶藻作用及机理分析

2．1 材料与方法

2．1．1 藻种与培养基

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

2．1．4 不同浓度L-赖氨酸抑藻效率测定

2．1．5 粗酶液的制备

2．1．6 生理指标的测定

2．1．7 叶绿素自发荧光分析

2．1．8 微囊藻酸性多糖分析

2．1．9 多糖合成酶基因和c-di-GMP代谢酶基因转录活性分析

2．1．10 细胞表面形态分析

2．2 结果与讨论

2．2．2 L-赖氨酸对叶绿素a和藻体胞内蛋白质含量的影响

2．2．3 L-赖氨酸对超氧自由基(O2-)、丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)的影响

2．2．4 L-赖氨酸对微囊藻胞外多糖含量的影响

2．2．5 L-赖氨酸对多糖合成酶基因转录活性的影响

2．2．6 L-赖氨酸对c-di-GMP代谢酶基因转录活性的影响

2．2．7 L-赖氨酸对微囊藻细胞表面形态的影响

2．3 本章小结

第三章 L-赖氨酸的溶藻范围及对产藻毒素藻株Microcystis aeruginosa FACHB-905的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 藻种与培养基

3．1．2 试剂与仪器

3．1．6 生理指标的测定

3．2 结果与讨论

3．2．2 不同浓度的L-赖氨酸对M．aeruginosa FACHB-905生长的影响

3．2．3 L-赖氨酸对M．aeruginosa FACHB-905胞内蛋白含量和叶绿素a的影响

3．2．4 L-赖氨酸对M．aeruginosa FACHB-905丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)活性的影响

3．2．5 L-赖氨酸对M．aeruginosa FACHB-905释放微囊藻毒素(MCs)的影响

3．3 本章小结

第四章 Microcystis aeruginosa NaRes975基因组测序及多糖合成酶与环二鸟苷酸代谢酶基因分析

4．1 材料与方法

4．1．1 基因组DNA的提取

4．1．2 基因组测序

4．1．3 基因组信息分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 M．aeruginosa NaRes975基因组的基本信息

4．2．2 多糖合成相关基因的筛选与分析

4．2．3 环二鸟苷酸代谢基因的筛选与分析

4．3 本章小结

第五章 Microcystis aeruginosa NaRes975多糖合成酶基因的克隆与异源表达

5．1 材料与方法

5．1．1 培养基与试剂

5．1．2 实验仪器

5．1．3 菌株和质粒载体

5．1．4 多糖合成酶基因celA重组质粒的构建

5．1．5 多糖合成酶基因celA的异源表达

5．2 结果与讨论

5．2．1 M．aeruginosa NaRes975基因组DNA和空载质粒pET-32a(+)的抽提

5．2．2 多糖合成酶基因celA的克隆与序列分析

5．2．3 重组质粒pET-32a(+)-celA阳性克隆验证

5．2．4 重组大肠杆菌中多糖合成酶基因celA的诱导表达

5．3 本章小结

第六章 Microcystis aeruginosa NaRes975环二鸟苷酸代谢酶基因的表达与包涵体复性

6．1 材料与方法

6．1．1 试剂与仪器

6．1．2 菌株和质粒载体

6．1．3 c-di-GMP代谢酶基因重组质粒的构建

6．1．4 c-di-GMP代谢酶基因的异源表达

6．1．5 包涵体的洗涤、变性与复性

6．2 结果与讨论

6．2．2 重组质粒pET-32a(+)-cdgm阳性克隆验证

6．2．3 c-di-GMP代谢酶基因的异源表达

6．2．4 包涵体蛋白的复性

6．3 本章小结

第七章 结论与建议

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文