非编码RNAs miR-148a-3p、lincARDD1在反复胚胎种植失败蜕膜化中的作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一章 MiR-148a-3p在反复胚胎种植失败蜕膜化中的作用及机制研究
　　反复胚胎种植失败（recurrent implantation failure，RIF）是指经历多次优质胚胎移植仍未获临床妊娠，是辅助生殖领域亟待解决的临床难题和研究热点。RIF病因高度异质，其中子宫内膜基质细胞蜕膜化异常是导致胚胎种植失败的重要因素。目前，蜕膜化启动、建立和维持的确切机理尚不十分清楚，且既往研究多围绕蛋白编码基因的功能，不足以解释子宫内膜基质细胞蜕膜化的复杂变化和周期差异。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约22个核苷酸的单链非编码RNA分子，通过诱导靶基因mRNA降解或抑制蛋白翻译参与调控细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学过程，在疾病发生发展过程中发挥重要作用。目前，miRNAs在人类蜕膜化过程中的研究，多是应用测序或芯片技术筛选体外诱导蜕膜化前后基质细胞中差异表达的miRNAs，或是人着床前期与着床期子宫内膜组织中差异表达的miRNAs，miRNAs在RIF蜕膜化异常这一病理过程中的功能机制研究还相对薄弱。
　　目的:构建RIF蜕膜化相关的miRNAs表达谱;选择可能参与调控子宫内膜基质细胞蜕膜化进程（增殖、分化）的miRNAs及其结合蛋白进行作用及机制研究，从表观遗传角度探讨miRNAs参与RIF发生发展过程的分子机理。
　　方法:应用miRCURYTM芯片筛选RIF患者与对照者着床期子宫内膜组织中差异表达的miRNAs，利用RT-qPCR在芯片送检样本中验证候选miRNAs的表达趋势;参考miRNAs相对表达丰度、差异表达倍数、生物信息学分析和mRNA表达谱芯片结果等，选择hsa-miR-148a-3p及其预测靶基因HOXC8在独立样本中进一步验证。借助体外功能实验和机制研究，明确异常表达的miR-148a-3p对RIF蜕膜化的影响和作用机制:在基质细胞中过表达miR-148a-3p，应用CCK8、EdU、PCNA Western Blot和体外诱导蜕膜化实验分析miR-148a-3p上调对基质细胞增殖、分化的影响;双荧光素酶报告实验等验证miR-148a-3p对靶基因HOXC8的调控机制;沉默基质细胞中内源性HOXC8，重复上述实验，明确miR-148a-3p降调HOXC8基因对基质细胞蜕膜化的影响和作用机制。
　　结果:在miRCURYTM芯片检测出的157条差异表达的miRNAs中，我们筛选了22条miRNAs在18例芯片送检样本中进行验证，发现hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-937-3p在RIF患者着床期子宫内膜组织中表达上调;选择miR-148a-3p及其预测靶基因HOXC8在独立样本中进一步验证，发现miR-148a-3p在RIF患者中的表达显著上调。过表达基质细胞中miR-148a-3p抑制基质细胞分化;RT-qPCR、Western Blot和双荧光素酶报告实验证实miR-148a-3p通过与HOXC8基因3'UTR区域结合降调HOXC8;特异性沉默内源性HOXC8抑制基质细胞分化，与过表达miR-148a-3p对基质细胞的作用类似。
　　结论:RIF患者着床期子宫内膜组织中显著上调的miR-148a-3p可能通过降调HOXC8基因抑制基质细胞分化，阻碍蜕膜化进程，从而影响胚胎植入，导致胚胎种植失败的发生。
　　第二章 LincARDD1在反复胚胎种植失败蜕膜化中的作用研究
　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子，通过基因组印记、染色质修饰、转录调控及转录后调控等多种调控方式，参与细胞增殖与凋亡、细胞周期、癌症侵袭与转移等众多生理和病理过程。与人类子宫内膜蜕膜化和胚胎植入过程中miRNAs的研究相比，lncRNAs的研究还处于起步阶段，其在RIF中的功能机制研究尚处空白。
　　目的:构建RIF相关的lncRNAs表达谱;明确异常表达的lncRNAs对子宫内膜基质细胞蜕膜化进程（增殖、分化）的影响，从表观遗传角度探讨lncRNAs在RIF蜕膜化过程中的作用。
　　方法:应用lncRNA芯片筛选RIF患者与对照者着床期子宫内膜组织中差异表达的lncRNAs，利用RT-qPCR在芯片送检样本中验证候选lncRNAs的表达趋势;参考lncRNAs序列信息、相对表达丰度、差异表达倍数、mRNA表达谱芯片结果等，选择lncRNA-CTD-2659N19.9(将其命名为lincARDD1，lincRNAActivated in RIF with Decidualization Deficiency1)在独立样本中进一步验证。应用数据库在线分析、核质分离和荧光原位杂交实验分析lincARDD1的编码潜能和亚细胞定位，明确其分子生物学属性。在基质细胞中过表达lincARDD1，借助CCK8、EdU、PCNA Western Blot和体外诱导蜕膜化实验，明确异常表达的lincARDD1对基质细胞增殖、分化的影响。
　　结果:在lncRNA芯片检测出的1292条差异表达的lncRNAs中，我们筛选了12条lncRNAs在18例芯片送检样本中进行验证，发现lncRNA-G010578、GSE61474 XLOC_010101、GSE61474_XLOC_018858、CTD-2659N19.9、G086718在RIF患者着床期子宫内膜组织中表达上调;选择lincARDD1在独立样本中进一步验证，发现lincARDD1在RIF患者中的表达显著上调。基因间长链非编码RNA lincARDD1不具备蛋白编码潜能，在基质细胞的胞核和胞质中均有表达。过表达基质细胞中lincARDD1抑制基质细胞增殖，不影响基质细胞分化。
　　结论:RIF患者着床期子宫内膜组织中显著上调的lincARDD1可能通过抑制基质细胞增殖，影响胚胎植入，参与胚胎种植失败的发生，具体分子调控机制还有待进一步研究。
　　第三章 HCG血清miRNAs、 lincARDD1表达水平对子宫内膜容受性的预测价值
　　子宫内膜容受性异常导致约2/3的胚胎种植失败，成为进一步提高辅助生殖临床妊娠率的瓶颈。准确评估子宫内膜容受性，选择合适的胚胎移植时机，能有效避免优质胚胎资源的浪费，有助于改善辅助生殖的助孕结局及治疗前景。然而，目前生殖临床中仍缺乏准确有效、简易方便的内膜容受性评价指标。随着对ncRNAs生物学功能和调控机制研究的深入，循环ncRNAs在疾病预测、诊断、治疗及预后中的作用日益受到重视。近年来，越来越多的,ncRNAs，尤其是miRNAs被发现参与调控子宫内膜容受性建立，其循环表达水平有望成为评估子宫内膜容受性的新型生物标志物。既往报道和我们的研究显示miR-148a-3p、miR-181a、miR-222、miR-542-3p、miR-181b-5p、miR-30d和lincARDD1参与调控内膜容受性建立，其循环表达水平对子宫内膜容受性的预测价值尚无文献报道。
　　目的:评估HCG日血清miR-148a-3p、miR-181a、miR-222、miR-542-3p、miR-181b-5p、miR-30d、lincARDD1表达水平对IVF/ICSI胚胎移植前子宫内膜容受性的预测价值。
　　方法:募集因输卵管或男方因素就诊并首次接受IVF/ICSI助孕的不孕症女性患者108例，留取新鲜HCG日血清。应用RT-qPCR比较胚胎移植后未着床、着床两组间HCG日血清中miRNAs、lincARDD1的表达水平。
　　结果:应用RT-qPCR基本检测不到血清样本中lincARDD1的表达,因此未继续研究血清中lincARDD1表达水平对子宫内膜容受性的预测价值。校正HCG日子宫内膜厚度后，发现HCG日血清中miR-542-3p在未着床组中表达下调，余miRNAs的表达无统计学差异。ROC曲线分析显示miR-542-3p区分着床与未着床的AUC为0.626（截断值:0.0010，95％CI:0.513-0.740，P＜0.05）;联合分析HCG日血清miR-542-3p表达水平与子宫内膜厚度，两者联合区分未着床与着床的AUC为0.669（95％CI:0.562-0.776，P＜0.05）。
　　结论:联合分析HCG日血清miR-542-3p表达水平与子宫内膜厚度，可有效评估IVF/ICSI胚胎移植前的子宫内膜容受性，对移植前内膜容受性的临床预测具有一定提示作用。

目录

声明

摘要

符号说明

序言

第一章 MiR-148a-3p在反复胚胎种植失败蜕膜化中的作用及机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 LincARDD1在反复胚胎种植失败蜕膜化中的作用研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三章 HCG日血清miRNAs、lincARDD1表达水平对子宫内膜容受性的预测价值

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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