临床白色念珠菌的耐药特性研究及唑类耐药菌选择性抑制剂的发现

摘要

近年来，随着抗真菌药物以及免疫抑制剂的大量使用，器官移植、放化疗、血液透析等治疗方法的广泛应用，真菌感染已成为重要的临床感染病症之一。其中，白色念珠菌(Candida albicans)是临床感染最常见的机会性致病菌。唑类药物以其高效、低毒、生物利用度高等优点成为临床一线抗真菌药物。但由于唑类药物的长时间大剂量使用，真菌唑类耐药性逐渐出现并迅速蔓延，耐药已成为越来越多临床真菌感染治疗失败的主要原因。因此，探究临床白色念珠菌的唑类耐药机制至关重要。
　　我们采用最低抑菌浓度筛选模型，评价了61株临床白色念珠菌对5种唑类药物的敏感性，从中发现了22株临床菌对2种以上唑类药物均表现出耐药特性。其中，有18株菌在30℃耐药，但当温度升高到35℃，甚至更高时，又恢复为敏感菌株;而另外的4株（28A、28D、28I和28J）无论在30。C还是更高温度都表现出对5种唑类药物稳定的耐药特性。
　　采用流式细胞技术，实时定量PCR，基因测序及酵母异源表达等实验检测方法，我们发现在这22株耐药菌中，有8株耐药菌表现出较高的外排泵活性，并伴有外排泵编码基因CDR1、CDR2和MDR1的高表达。7株耐药菌的ERGll基因高表达，并发现其调控基因UPC2上存在突变点。一些新的突变点也在ERG3、ERG11及锌指转录因子(zinc-finger transcription factor)基因TAC1和CAP1中检测到。其中，经验证发现，Erg3中S265Y、N324S和N322D的联合突变能够增强白色念珠菌对氟康唑的耐药性。同时，我们发现这些菌株的耐药特性依赖于热休克蛋白90(Hsp90)和钙调磷酸酶(calcineurin)的存在，当加入Hsp90或钙调磷酸酶抑制剂时，菌株的耐药特性被逆转。通过实验，我们对临床白色念珠菌的耐药特性有了更深层次的认识和了解。
　　临床白色念珠菌的感染往往是唑类敏感菌和耐药菌混合感染，且随着唑类药物用药时间的延长，敏感菌被逐步清除，或被诱导成为耐药菌，导致耐药菌成为感染的优势菌群。因此，寻找对唑类耐药菌有抑制活性的化合物是研究开发新药的重要策略。天然产物，尤其是来源于植物的天然产物，一直是寻找抗真菌药物的资源库。本课题组在前期研究中发现5个具有潜在抗真菌活性且较易获得的天然小分子化合物，分别是:从苔藓植物中分离得到的双联苄类化合物riccardin D(RD)，从云南光肺地衣中分离得到的三萜类化合物retigeric acid B(RAB)，从地衣内生真菌次生代谢产物中分离得到的吡哆醇类化合物pyridoxatin(PYR)，二苯醚类化合物diorcinolD(DD)和庚烯酮类化合物biatriosporin D(BD)。
　　在此基础上，我们模拟临床感染实际情况，构建了绿色荧光标记的敏感菌与不同因素导致的耐药菌混合培养的模型，对上述5个天然产物重新评价，挖掘可以选择性抑制唑类耐药菌的化合物。实验发现上述5种化合物都可以同时抑制敏感菌和耐药菌。其中，化合物BD可以选择性抑制YEM13和YEM15的生长，而对其他唑类耐药株并没有倾向性抑制作用。PYR和DD则对敏感株具有更高的抑制作用。而RAB和RD对由Mdr1强启动或其调控因子MRR1突变引起的Mdr1高表达耐药菌均具有选择性抑制作用。外排泵Mdr1高表达是常见的临床唑类耐药机制，因而，研究RAB和RD对Mdr1高表达耐药菌选择性抑制的产生机理，对研究和开发抗真菌新药具有重要意义。
　　通过高效液相分析药物胞内含量差异，我们发现RAB和RD在Mdr1高表达耐药菌胞内积累增多;气-质联用分析菌体细胞膜成分结果显示，Mdr1高表达耐药菌细胞膜中甾醇和脂质含量改变。我们推断，Mdr1高表达耐药菌细胞膜成分的变化导致细胞膜的通透性改变，RAB和RD更易进入细胞，造成胞内药物含量较多。前期研究发现，RAB和RD可以通过干扰甾醇合成通路发挥抗真菌作用，且实验发现，Mdr1高表达耐药菌中甾醇合成相关基因表达下降，甾醇合成通路异常;RAB和RD加剧了这种异常，使得麦角甾醇含量下降，甾醇中间体含量增多，表现出更强的抑制作用。
　　本论文对临床61株白色念珠菌进行筛选，得到了22株唑类耐药菌，其中4株表现为稳定耐药。通过分析研究，发现了多种耐药机制，丰富了临床白色念珠菌的耐药机制研究，加深了对白色念珠菌耐药特性的认识，为指导临床用药和联合用药提供了新思路。同时，我们建立了临床感染体外模型，对前期发现的天然产物进行了重新评估，并阐明了RAB和RD选择性抑制Mdr1高表达的唑类耐药菌的机制，为研究和开发清除耐药菌的新药提供了理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 临床念珠菌感染现状

1．2 抗真菌药物及作用机制

1．3 真菌耐药机制

1．4 克服真菌耐药策略

1．5 天然产物与抗真菌药物

参考文献

第二章 临床白色念珠菌耐药性筛选

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

参考文献

第三章 临床白色念珠菌耐药机制研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

参考文献

第四章 选择性抑制唑类耐药白色念珠菌的天然产物筛选及其机制研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

参考文献

致谢

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